in vivo CAR-T 的体内外药理学研究

in vivo CAR-T是近年来细胞治疗领域的热点方向之一，代表着与传统体外（ex vivo）制备完全不同的技术路线。相比于需经历白细胞单采、体外转导、扩增、放行检验等7–22天复杂流程的ex vivo CAR-T，in vivo CAR-T直接将携带CAR基因的递送载体注射入患者体内，由体内T细胞原位完成转导与活化，起效时间可缩短至 1–3天，兼具低成本、可工业化生产、即用型（off-the-shelf）等优势，但其“体内生成”的特性也对药理学评价体系提出了新的要求[1]。

目前主流技术平台可分为两类：以慢病毒为代表的整合型载体，经逆转录将CAR基因永久整合入 T 细胞基因组，特点是靶向驱动扩增、持久性强，多用于单次给药的肿瘤适应症；以及以 LNP／聚合物制剂化mRNA（线性或环状 RNA）为代表的非整合型载体，通过内吞与内体逃逸递送 RNA，特点是起效快、表达随细胞分裂逐渐衰减，更适合需要重复给药的自身免疫适应症[2,3]。两类平台在作用机制上的本质差异，决定了体外与体内药理学研究设计思路的不同。本文结合公开文献及昭衍新药自建评价平台数据，对in vivo CAR-T产品体外与体内药理学研究的关注要点做一梳理。

体外药理学研究

体外药理学评价主要围绕三个问题展开：递送效率与特异性、体外杀伤活性、抗原遮蔽风险。

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递送效率与特异性

基本思路是用供试品感染PBMC，流式检测不同细胞亚型（T、B、NK、单核细胞）CAR阳性细胞的比例，评价载体对靶细胞的选择性。如Umoja Biopharma靶向CD3的慢病毒产品UB-VV111（靶点 CD19）对T细胞表现出良好的选择性转导，对B细胞、单核细胞、NK细胞的脱靶转导极低[4]；深圳虹信生物靶向CD8的LNP产品HN2301（靶点 CD19）同样表现出CAR在CD8+T细胞中的高度富集[5]。试验设计需关注：应在多个供体、健康人及患者来源PBMC中开展，以覆盖个体差异；需明确转导前是否经过预激活处理；不同载体（LNP起效快、慢病毒起效慢）应设置各自适宜的检测时间点，不宜以统一时间点直接比较。

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体外杀伤活性

将PBMC或T细胞与供试品孵育后加入靶细胞，检测生成的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤能力、细胞因子分泌及T细胞活化（如CD107a脱颗粒、4-1BB 表达）与增殖情况，并设置抗原阴性细胞系作为特异性对照，效靶比与时间点应设置梯度。以Capstan Therapeutics的CPTX2309为例，其在CD19阳性的NALM6细胞上呈现明显的剂量依赖性杀伤，而在CD19阴性K562细胞上无杀伤活性，同时伴随CD107a、4-1BB上调及T细胞增殖[6]。针对自身免疫适应症的产品，还需增加健康人及患者自体B细胞清除试验[5,7]，且建议在多个供体中开展，以代表患者群体的疾病异质性。

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抗原遮蔽试验

这一评价项目源于真实的临床教训——2018 年《Nature Medicine》报道，诺华CTL019制备过程中一个白血病B细胞被意外转导上CAR基因，其表面表达的CAR以顺式方式结合并遮蔽了自身CD19靶点，使其逃避CAR-T细胞识别，最终引发复发[8]。对于in vivo CAR-T，由于体内递送无法像体外制备那样进行严格的细胞分选，脱靶感染肿瘤细胞或自身B细胞在理论上是存在的风险。如Interius的INT2104评价体系中即专门设计了抗原遮蔽试验：一方面在健康原代B细胞、多种肿瘤细胞株及患者来源B细胞中检测转导效率；另一方面强制使B淋巴瘤细胞表达CAR，再与供试品生成的CAR-T／CAR-NK细胞共培养，验证即便靶细胞被误转导，仍可被有效清除[9]。

体内药理学研究

体内评价通常分为人源化小鼠模型与非人灵长类（NHP）模型两条主线，整体逻辑是：人源化小鼠承担概念验证与抗肿瘤药效评价，NHP 则在药理学、生物分布、免疫应答、持久性及安全性等维度提供从临床前到临床转化的重要桥梁。

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人源化小鼠模型：Hu-PBMC 与 Hu-HSC

常用重建方式包括Hu-PBMC与Hu-HSC，二者各有取舍（见表1）[10,11]。载体类型不同，模型选择也随之不同：病毒载体产品建议采用 HSC 重建模型以获得更长观察期；LNP载体产品建议采用PBMC重建模型并需荷瘤评价，必要时可采用DKO小鼠以延缓GvHD发生。

表1 Hu-PBMC与Hu-HSC人源化重建模型比较

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昭衍自建评价平台

基于上述经验，昭衍新药已建立起较为完整的体内评价能力。在PBMC免疫重建模型的供体筛选中，通过对多个供体 hCD45+人源细胞重建比例及小鼠体重变化的系统追踪，筛选出重建效率高、个体差异小、GvHD发生较晚的标准供体，作为后续药效研究的基础：

图1 昭衍PBMC免疫重建模型——多供体hCD45%重建效率及体重变化筛选

在此基础上构建的PBMC免疫重建荷瘤模型覆盖血液瘤（NCI-H929多发性骨髓瘤模型、Daudi 淋巴瘤模型）：

图2 昭衍PBMC免疫重建荷瘤模型——血液瘤（NCI-H929、Daudi）

以及实体瘤（表达HER2的NCI-N87、表达Claudin18.2NUGC4、表达间皮素的PANC1、表达GPC3的HepG2），均可观察到稳定的肿瘤生长曲线：

图3 昭衍PBMC免疫重建荷瘤模型——实体瘤（NCI-N87、NUGC4、PANC1、HepG2）

针对需要更长观察窗口和更完整免疫背景的研究需求，昭衍同时建立了CD34免疫重建荷瘤模型：

图4 昭衍CD34免疫重建荷瘤模型（NCI-H929）

在此基础上完成的小鼠体内药效学试验（免疫缺陷小鼠人源化后接种Nalm6-luc肿瘤细胞，按BIW频率给予供试品）显示，供试品组肿瘤负荷较对照组受到显著抑制，停药后仍能维持一段时间的肿瘤控制效果，同时可检测到CAR阳性T细胞的持续表达：

图5 昭衍小鼠体内药效学试验设计与结果（肿瘤负荷抑制及 CAR+ T 细胞检测）

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B 细胞清除药效与补充模型

对于自身免疫适应症产品，体内评价的核心终点是B细胞清除。Interius的INT2104与Capstan的CPTX2309均在CD34人源化小鼠模型中展示了深度、快速的B细胞清除效果，同时监测CAR-T细胞在骨髓、脾脏、肝脏等组织中的分布，为后续毒理及药代研究的剂量选择提供依据[7,9]；给药前是否经过T细胞活化预处理（如IL-7）也会影响清除动力学，需一并纳入设计考量。转基因动物（如hCD8/hCD19双转基因小鼠）可作为补充模型，优势在于具备完整天然免疫系统且可直接使用临床分子，但人源CAR胞内结构域在鼠源T细胞中的兼容性、以及不同靶点／共刺激结构域需匹配不同转基因动物等局限。

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NHP 模型：临床转化的关键桥梁

NHP模型是弥补人源化小鼠免疫系统重建不完全这一短板的关键桥梁，具备完整免疫系统，能更全面地反映急性炎症反应、细胞因子释放综合征和神经毒性等系统性安全性问题[12]，转染效率也更贴近临床，并可支持淋巴结内注射等特殊给药途径的探索及剂量转化。HN2301的食蟹猴非临床安全性数据与5例患者临床数据的系统比对显示，细胞因子释放综合征、神经毒性、靶向B细胞清除、肝肾功能四个维度均呈现高度一致的非临床—临床相关性[5]，是NHP模型转化价值的有力例证。

种属选择需结合载体特性：慢病毒载体的种属特异性与恒河猴TRIM5α蛋白对HIV-1衣壳蛋白的特异性识别有关，该蛋白可在逆转录早期阻断病毒复制，其抑制能力远强于人源蛋白，故慢病毒对豚尾猴感染效率较高，而在食蟹猴、恒河猴中感染能力明显偏弱[13,14]；因此采用慢病毒平台的in vivo CAR-T产品在设计NHP试验时，往往需要选用来源受限的豚尾猕猴，或对病毒衣壳、Binder及CAR分子进行种属替代设计。

以CPTX2309在食蟹猴上开展的0.1–2.0 mg/kg剂量爬坡试验为例，检测指标涵盖 CAR 阳性率、B细胞清除率（流式与免疫组化交叉验证）、免疫重置情况，并结合毒理与组织分布指标综合评估，结果显示B细胞清除呈明显的剂量依赖性[7]。

in vivo CAR-T产品的药理学评价体系应遵循“Case by case”原则——根据载体类型、Binder、靶点及CAR分子设计，结合临床适应症制定针对性的评价方案；应“以终为始”，始终以临床价值为导向，充分考虑临床前到临床的转化路径；更应“基于科学、基于数据”，通过体外递送效率、杀伤活性与抗原遮蔽评价，结合体内人源化小鼠与NHP模型的分层评价策略，充分研究、最大化发掘产品的临床潜能，为该类新型细胞治疗产品的研发与非临床评价提供参考。

参考文献

[1] Xu J, Chen Z, Su L, Ren A, Mei H. In vivo CAR cell therapy: from bench to bedside. J Hematol Oncol. 2025 Nov 20;18(1):105. doi: 10.1186/s13045-025-01759-2. PMID: 41261423; PMCID: PMC12632109.

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[3] King EA, Meyers M, Nomura DK. Induced proximity-based therapeutic modalities. Nat Rev Drug Discov. 2026 Feb;25(2):116–137. doi:10.1038/s41573-025-00132-3.

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