In Vivo CAR-T 产品非临床关注要点

In Vivo CAR-T 产品可以解决传统体外CAR-T 制备复杂、价格昂贵、适用人群受限等难题，成为目前基因治疗产品研究的热点。但是由于其“体内生成”的特性，也带来了独特的非临床安全性挑战。目前，针对于In Vivo CAR-T产品没有明确的指导原则，非临床毒理学研究需结合产品的递送载体特性、作用机制、临床适应症等，参考ICH M3、ICH S9、细胞和基因治疗产品研究相关的指导原则，全面合理的设计相关的非临床毒理学研究，以期为该类产品的研发和评价提供参考。本文就本机构的评价经验结合目前临床阶段产品的文献资料，对非临床毒理学评价的关注要点总结如下。

供试品的质量要求

对于In Vivo CAR-T产品，对供试品的要求和其他细胞和基因治疗产品要求基本一致，总体原则为供试品应能充分代表临床拟用样品的质量和安全性，具体描述如下：

1

临床分子

要注意与临床用样品的一致性，载体特性方面要关注表面修饰的稳定性和生产滴度。生产和质控方面要关注载体纯度、内毒素水平、复制慢病毒（RCL）检测粒径，包封率等；杂质控制方面，工艺相关的杂质应与临床样品相一致且不低于临床用样品。

2

替代分子

对于尚无公开报道的载体及靶向抗体的文献支持数据；对CAR结构的靶点尚无公开报道，靶点的分布特征和安全性数据缺乏了解，且CAR结构的靶点与动物不结合；或者为了在免疫功能正常的动物上考察可能存在的免疫原性/毒性反应或脱靶毒性等，必要时会采用替代分子进行试验。无论是通过改变病毒包膜蛋白还是改变核酸序列等的替代分子，一定要注意充分的药学研究和对比，以确保其与临床分子的可比性和代表性。

相关动物种属的选择

非临床毒理学研究中，选择合适的动物种属是试验成功的关键，对于In Vivo CAR-T 产品的动物种属选择，总体考虑：

1

靶抗体的种属相似性

需要考虑产品的靶向抗体部分对靶细胞或靶组织的结合活性，其生物分布或生物。

2

载体的递送效率

不同的递送系统对靶细胞的转导效率或转染的效率与人体的相似性。

3

CAR结构的种属结合活性

用于构建CAR的SCFV或VHH，其靶点亲和活性与人的相似性。

4

药理学活性

动物体内能够产生和人体类似的药理活性。

啮齿类动物：结合不同的动物模型特点、免疫重建细胞类型、重建时长及优缺点（在上一期In Vivo CAR-T 产品药理学评价中已经详述），建议选择Hu-PBMC或Hu-HSC免疫系统人源化的小鼠开展安全性评价试验，对于病毒载体为递送系统的产品，建议采用Hu-HSC重建模型，以期有更长的观察周期，是否负载肿瘤取决于产品的适应症和靶点。对于LNP为递送系统的产品，建议采用Hu-PBMC重建模型且负载肿瘤；为了避免或减缓GvHD的产生，必要时可采用DKO-NXG小鼠进行Hu-PBMC重建。

非啮齿类动物：针对病毒载体为递送系统的产品，首先考虑病毒载体对T细胞的转导效率与人体相似；靶向T细胞抗体和CAR在动物的结合活性与人相似；以慢病毒LV载体为例，猕猴的转导效率与人体差异比较大，豚尾猴和犬与人体的接近。针对LNP为递送系统的产品，LNP对种属无特异选择性，要求靶向T细胞抗体和CAR在动物的结合活性与人体相似。此外，若LNP中有全新的成分，需要获得新成分或LNP的2个种属（啮齿类和非啮齿类）的毒理学研究数据。临床阶段所用的动物种属和分子类型见表1。

表1 临床阶段所用的动物种属和分子类型

单次/重复毒理试验的设计

该试验是非临床安全性评价中的核心试验。开展正式试验之前，进行充分的探索性试验，初步判断产品的毒性反应。

毒性试验至少采用一种相关动物种属开展，必要时使用两种动物；需要设计至少2个供试品剂量组，剂量应涵盖非临床药效模型确定的药效剂量范围或拟推荐的临床剂量范围，也需要考虑辅料对照及阴性双对照。综合前期药效和分布结果的基础上，给药次数要大于等于临床，给药间隔小于等于临床，用药周期参考ICH M3覆盖临床。对于病毒载体的产品，单次给药后，观察周期建议至少13周以充分考察可能的毒性反应。对于非病毒载体的产品，观察周期覆盖临床给药周期即可。检测指标除常规毒性观察指标外，需要特别关注给药后动物出现的急性炎症反应，应结合产品特点以及细胞和基因治疗产品特性，考察载体和导入基因在体内的转录/翻译、分布、存续情况，病毒载体的插入和整合风险以及病毒的脱落风险；非病毒载体中阳离子脂质或者新成分的毒性或全制剂给药后带来的补体激活的效应。在临床研究阶段的产品的毒理学研究动物种属、途径、剂量及主要毒性结果见表2。

表2 临床阶段产品的毒理学研究动物种属、途径、剂量

及主要毒性结果

安全药理试验

对于In Vivo CAR-T产品，安全药理研究可以伴随在毒性试验中进行。

中枢神经和呼吸功能：伴随人源化小鼠进行FOB和/或WPS进行检测，在尽量确保不影响毒性指标观察的前提下，设置3-5个FOB和/或WPS观察时间点。

心血管功能：结合体外TCR、MPA中相关的组织细胞的结合数据，以及该产品在心脏的分布情况，在毒性试验中还可以检测心脏功能指标如LDH、CK、肌钙蛋白以及心脏病理等的改变情况进行综合评估。此外，如果在毒性试验评估中发现在心脏毒性潜在的担忧时，可采用心脏类器官进行相关研究进行补充研究。

当开展大动物的毒性试验时，可伴随检测心电、血压、呼吸指标，考察安全药理。

免疫原性和免疫毒性的考虑

基于In Vivo CAR-T产品特点，无论采用病毒载体还是非病毒纳米载体，均需要考察可能的免疫原性，以评估对药物代谢特征和药理学效应的影响，对于病毒类载体，还需要考虑预存免疫的影响。非临床研究中，可通过体外方法预测和检测细胞因子释放风险或可能存在的免疫反应。对于体内研究，免疫缺陷或免疫重建的动物由于免疫功能的限制，无法考察免疫原性，如果要进行免疫原性研究需要采用免疫功能正常的动物，如果使用了替代分子，需要考虑健康动物给予替代分子与临床分子的差异，以及由此带来的免疫原性和毒性的差异，免疫原性的检测指标和具体方法见表3。

表3 不同载体免疫原性/免疫毒性检测方法

脱靶毒性研究分析

对于In Vivo CAR-T产品，载体或者靶向抗体误改正常细胞或者CART在体内过度表达，就会引起基因突变、致癌性风险或者细胞因子风暴，因此脱靶毒性是非临床评价中关注的重点。我们可以通过体外方法：如膜蛋白阵列（MPA）、组织交叉试验（TCR）等方法检测SCFV和靶向抗体可能存在的脱靶风险，且要注意不同的公司进行MPA试验时对标记物、浓度、纯度等的不同需求、以及MPA本身存在的不足和MPA阳性时如何进行结果分析和综合判定。另外，也可以通过体内试验，如伴随分布或毒性试验进行IHC，RNAscope等相关检测。

遗传毒性与致癌性

对于病毒载体产品（如慢病毒），常规的遗传毒性试验不适用，通常不需要进行标准的遗传毒性组合试验。如果是整合病毒载体，需重点评估载体随机整合至宿主基因组的插入突变风险，评估其激活原癌基因或抑癌基因失活的致癌风险，需结合载体拷贝数（VCN）及整合位点分布进行分析。对于纳米颗粒载体（如LNP-mRNA），虽无基因组整合风险，但需评估RNA或LNP脂质成分等可能诱发的遗传毒性，以及表达产物对细胞异常增生的潜在影响。进行Ames研究时需要考虑细菌能否吞噬纳米颗粒，避免导致试验无效。必要时采用体外哺乳动物细胞HPRT基因突变试验或者小鼠淋巴瘤试验（MLA）来替代传统的Ames。

生殖毒性

生殖/发育毒性风险评估，研究策略可参考ICH S5（R3）、ICH M3（R2）、ICH S6、ICH S9等相关指导原则。通过前期组织交叉试验结果，组织分布研究和毒性试验中生殖系统以及生殖细胞的分布数据，以及毒性试验中生殖器官的病理组织学研究结果，综合判定是否需要开展生殖毒性研究。对于非肿瘤适应症，基于WOE评估的基础上，支持大规模临床或者上市前，还需要考虑生殖发育毒性。若存在潜在生殖器官毒性反应，应开展生育力和早期胚胎发育毒性试验，且要考虑进行胚胎-胎仔发育毒性和围产期毒性研究。对于病毒载体的产品可以参考基因治疗相关原则评估生殖传递风险；LNP的产品做相关研究时，需要注意种属的选择，必要时考虑采用替代分子进行。

总之，非临床毒理学研究作为规模较大、费时较长的研究，其设计一定要基于该产品前期充分的药效学研究、分布研究以及产品的个性化特点和适应症等因素综合评估和考虑，同时结合已处于临床的类似产品产生的毒性反应，对非临床毒理检测指标进行完善和补充。必要时需要与监管部门进行沟通，确定非临床毒理试验设计的合理性和科学性。

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