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资讯 肝内胆管癌（iCCA）是起源于肝内胆管上皮的原发性肝脏恶性肿瘤，临床侵袭性强、生物学异质性高。在HBV流行地区，慢性HBV感染被认为是iCCA发生的潜在促成因素，但残余病毒转录信号在HBV相关iCCA中的生物学和临床意义尚未明确。近期，海军军医大学东方肝胆外科医院团队在《Infectious Agents and Cancer》发表一项研究，首次通过组织定位、细胞功能实验和术后生存数据，探索了HBV pgRNA在HBV相关iCCA中的价值。研究发现，HBV pgRNA可在肿瘤上皮细胞中检测到，其过表达促进iCCA细胞的恶性与干性表型；临床分析中，术前高血清pgRNA水平是术后总生存（OS）和无复发生存（RFS）较差的独立预测因子
研究背景
乙肝病毒感染仍是全球公共卫生问题，全球约有2.54亿慢性感染者，每年导致约110万人死亡，主要死因为肝硬化及肝细胞癌；目前以核苷（酸）类似物（NA）为主的抗病毒治疗存在长期用药可能引发耐药和经济负担等局限。因此，寻找能够有效评估疗效、指导治疗调整的生物标志物至关重要。近年来，血清HBV RNA作为反映cccDNA转录活性的指标受到关注，因其在HBV DNA转阴后仍可能持续存在，显示出在监测疗效、指导停药及预测复发方面的潜力。在此背景下，北京大学人民医院联合北京大学基础医学院发表在BMC Gastroenterology上的最新研究旨在探索NA治疗期间HBV RNA的动态变化及其与HBV DNA、HBsAg的相关性，并评估其对病毒学应答和HBeAg血清学转换的预测价值，以推动HBV RNA成为临床实用的生物标志物。
研究方法
2020年至2024年间，来自中国九家医院的427名初治HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者被纳入研究。在24个月的核苷（酸）类似物治疗期间，分析了纵向HBV RNA-DNA-HBsAg相关性。评估了其对12个月时病毒学应答和24个月时HBeAg血清学转换的预测性能。
研究结果
HBV DNA、HBV RNA、以及HBsAg在治疗过程中水平均呈现下降趋势，HBV DNA下降最快，HBV RNA次之，HBsAg下降最缓慢。HBV RNA 的中位水平在基线、12 个月和 24 个月分别为6.63（4.60-7.61）、4.19（2.32-5.31） 和 2.10（2.00-3.02）log10 拷贝/mL；未产生病毒学应答患者具有更高的基线HBV DNA（中位数7.42 vs. 5.38 log10 IU/mL，）和HBV RNA（6.63 vs. 4.60 log10 copies/mL，）。
图1： 慢性乙型肝炎患者接受核苷（酸）类似物治疗后血清HBV标志物的变化。
(A) HBV DNA水平散点图。
(B) HBV RNA水平散点图。
(C) HBV DNA：HBV RNA比值散点图。
(D) HBsAg水平散点图
在HBV RNA与其他HBV血清学标志物的相关性分析中，结果显示在NA治疗前，HBV RNA与HBV DNA相关（r = 0.6380，P = 0.001），但与HBsAg无显著相关性（r = 0.1048，P = 0.0905）。在接受12个月NA治疗后，HBV RNA与HBV DNA（r = 0.5696，P = 0.0106）及HBsAg（r = 0.5196，P = 0.0010）均相关。在接受24个月NA治疗后，HBV RNA与HBV DNA的相关性消失（r = 0.6441，P = 0.0612），而与HBsAg仍保持强相关（r = 0.9167，P = 0.0005）。
对于病毒学应答（VR），12 个月的 VR 累积发生率为 49.4%（211/427）。6 个月的 HBV RNA（HR = 0.77，95% CI = 0.52–0.90，P = 0.03）、基线的HBV DNA/HBV RNA（HR = 2.51，95% CI = 1.46–4.32，P < 0.001）以及6 个月的 HBV DNA/HBV RNA（HR = 2.43，95% CI = 1.61–3.67，P < 0.001）与12 个月的 VR 相关。其中，HBV DNA/HBV RNA比值与12个月的VR最相关。
至于预测12个月的VR率以及24个月的HBeAg血清学转换率，HBV DNA的风险比为0.16（），受试者工作特征曲线下面积为0.889，而HBV RNA的风险比为0.77（），曲线下面积为0.754（表格4）。有关HBeAg血清学转换，HBV DNA的风险比为0.01（），曲线下面积为0.900，而HBV RNA的风险比为0.72（），曲线下面积为0.703，突显了它们在这个关键时间点一致的预后价值。
表格4：预测12个月发生病毒学反应（VR）及24个月发生HBeAg血清学转换的AUROC曲线
研究结论
在核苷（酸）类似物治疗期间，HBV RNA的动态变化经历了从与DNA相关到与HBsAg相关的转变。HBV DNA/RNA在6个月时的早期下降可以预测病毒学应答和HBeAg血清学转换，从而确立此时间点作为一个可靠且临床实用的早期预测点。HBV RNA补充了现有生物标志物，可用于优化慢性乙型肝炎的管理。
仁度生物自主研发的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒，以其独特的检测技术、高灵敏性和高特异性等特点率先获准上市。区别于传统的PCR技术，本试剂盒采用独特的SAT技术，即RNA实时荧光恒温扩增扩增技术，能对RNA分子进行直接扩增和定量，不受样本中的HBV DNA干扰，无需DNA酶处理，检测下限低至50 copies/mL，搭载AutoSAT全自动平台，消除手工操作误差、节约实验室人力物力，为乙肝患者保驾护航。
全程监测更安心 直接定量更精准
撰写：Brigette
审核：Candy
往期回顾
顶刊鉴析|HBV RNA在病毒学抑制情况下预测肝细胞癌的发生
顶刊鉴析|不同核苷类药物降低HBV RNA效果不同
顶刊鉴析|新型乙肝病毒标志物指导下的NA停药策略促进CHB患者乙肝HBsAg清除
- 顶刊鉴析|血清HBV RNA对DNA阴性慢性乙型肝炎肝纤维化进展的预测价值
免责声明：
本篇文章使用的图片等素材均源于互联网，我们尊重所有原创作者的权益权利，如果存在侵权，请及时联系我们删除。
关于仁度
上海仁度生物科技股份有限公司（股票代码：688193）成立于2007年，是国内最早一批专注于RNA分子诊断技术和产品的生命科学企业之一，致力于开发临床需求尚未满足的创新诊断技术和产品。公司拥有RNA实时荧光恒温扩增（SAT）的独家专利技术平台，以该技术平台为基础自主研发了一系列分子诊断试剂和设备一体化产品，专注于为生殖、呼吸、消化、血液、食品、环境安全等领域病原体的精准诊断、有效防控和个性化诊疗提供解决方案。
仁爱生命 度衡健康
专注病原体RNA临床检测
研究背景
流行病学和基因组学证据支持HBV感染与iCCA之间的关联，病毒整合和残余转录可能促进胆管癌发生。HBV pgRNA是HBV cccDNA的转录本，在长期核苷（酸）类似物治疗中，即使血清HBV DNA被抑制，HBV pgRNA仍可反映残余病毒转录活性。在HBV相关肝细胞癌中，HBV pgRNA已被认为与肿瘤干性、复发风险及预后相关。然而，HBV pgRNA在iCCA中的作用未知。本研究旨在表征pgRNA在HBV相关iCCA组织中的空间分布，评估HBV pgRNA过表达对iCCA细胞恶性及干性相关表型的影响，并探索术前血清HBV pgRNA状态与术后生存的探索性关联。
研究方法
本研究为单中心、回顾性、探索性研究，纳入了45例HBV相关iCCA患者，这些患者均接受了长期核苷（酸）类似物治疗，术前血清HBV DNA被抑制，并在根治性切除术后进行了评估。通过逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测组织HBV pgRNA表达，通过上海仁度生物科技股份有限公司实时荧光恒温扩增技术（SAT）检测血清HBV pgRNA，并通过免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH）评估空间定位。使用稳定的HBV pgRNA过表达HuCCT1和RBE模型来评估细胞活力、迁移、侵袭、集落形成以及干性相关蛋白的表达。采用Kaplan-Meier法、Cox回归和限制平均生存时间（RMST）分析来检验血清HBV pgRNA状态与术后结局之间的关联。
研究结果
1、HBV pgRNA的组织定位、功能相关性和临床关联
1.1 队列特征和探索性血清HBV pgRNA分层
在纳入临床分析的45例HBV相关iCCA患者中，所有患者均在长期抗病毒治疗后术前血清HBV DNA被抑制。通过血清HBV pgRNA 水平将样本分为BLQ（<100 copies /mL，n=30）、LOW（100-2700 copies /mL，n=8）和HIGH（>2700 copies /mL，n=7）组。肿瘤大小在各组间存在差异（P=0.008），HIGH组的肿瘤较大，而CA19-9无显著差异（P=0.506）。因此，肿瘤大小被纳入主要的OS和RFS模型中。
1.2 肿瘤组织中pgRNA与CK19的空间共定位
IF-FISH显示HBV pgRNA信号（红色）存在于细胞核和细胞质区室中。在CK19阳性（绿色）的胆管上皮区域，pgRNA信号与CK19显示出空间共定位。使用Fiji Coloc2工作流程进行共定位分析，显示两个信号之间存在中度正相关（Pearson's r=0.64）。经过Costes自动阈值处理后，阈值化Pearson's r为0.56；阈值化Manders系数为tM1=0.720，tM2=0.892。Costes随机化检验支持重叠超出偶然预期。这五个IF-FISH病例包括血清HBV pgRNA BLQ、LOW和HIGH层。鉴于缺乏RNase处理和乱序探针对照，这些发现被解释为描述性空间证据，而不是HBV pgRNA细胞内来源的证明。
1.3 肿瘤与癌旁非肿瘤肝组织间pgRNA表达的比较
通过qRT-PCR测量配对肿瘤和癌旁非肿瘤肝组织中的HBV pgRNA表达，并表示为相对pgRNA丰度。对数转换后，配对t检验分析显示肿瘤组织中的pgRNA表达显著低于配对的癌旁非肿瘤肝组织（P=0.010）。
在不同血清HBV pgRNA层中，肿瘤组织pgRNA表达（Welch ANOVA P=0.574）和癌旁非肿瘤组织pgRNA表达（P=0.093）在BLQ、LOW和HIGH组之间没有显著差异。在15例血清pgRNA可定量的患者中，血清HBV pgRNA与肿瘤组织pgRNA无显著相关性（Spearman ρ=0.314；P=0.254），但与癌旁非肿瘤组织pgRNA呈中度正相关（ρ=0.532；P=0.044）。由于可定量子集较小，这些相关性被认为是探索性的。
2、HBV pgRNA过表达与iCCA细胞中增强的恶性表型和干性相关特征相关
2.1 稳定pgRNA过表达细胞模型的建立与验证
体外功能测定显示，在两种HBV pgRNA过表达细胞模型中，恶性表型均增强。CCK-8测量显示，OE细胞在较晚时间点的细胞活力高于载体对照（图3A，B）。在HuCCT1（P=0.0037）和RBE（P=0.0042）OE细胞中，48小时伤口闭合率增加（图3C，D）。Transwell实验显示HuCCT1（P=0.0006和P=0.0027）和RBE细胞（P=0.0018和P=0.0004）的迁移和侵袭增加（图3E-G）。在HuCCT1（P=0.0117）和RBE（P=0.0002）OE细胞中，集落形成也增加（图3H，I）。
2.2 HBV pgRNA过表达与干性相关标志物上调相关
蛋白质印迹和光密度分析显示，HBV pgRNA过表达后多种干性相关蛋白的表达增加（图4）。在HuCCT1细胞中，CD44（P=0.0053）、ALDH1A1（P=0.0018）、CK19（P=0.0076）和CD24（P=0.0116）显著增加（图4A，B）。在RBE细胞中，CD44（P=0.0090）、ALDH1A1（P=0.0111）和CK19（P=0.0034）显著增加，而CD24无变化（P=0.4396；图4C，D）。这些发现支持HBV pgRNA过表达与更广泛的干性相关蛋白表型相关，而不是每个标志物的统一诱导。
3、术前血清HBV pgRNA与术后结局的探索性关联
3.1 术前血清HBV pgRNA与总生存
所有45例患者均纳入OS分析，随访期间有29例死亡。Kaplan-Meier分析显示，三个术前血清HBV pgRNA组之间的OS存在显著总体差异（log-rank P<0.001；图5A）。HIGH组的OS最差，而LOW和BLQ曲线更相似。
以BLQ为参考组，单变量Cox分析显示HIGH组死亡风险增加（HR=7.59，95% CI 2.79–20.65；P<0.001），而LOW组与BLQ无显著差异（HR=1.65，95% CI 0.64–4.27；P=0.303）。调整肿瘤大小后，HIGH组仍与死亡风险增加相关（校正后HR=5.22，95% CI 1.82–14.95；P=0.002），而LOW组仍不显著（校正后HR=1.18，95% CI 0.44–3.17；P=0.747）。肿瘤大小也与死亡率相关（校正后每增加1厘米HR=1.19，95% CI 1.05–1.35；P=0.008）。
3.2 术前血清HBV pgRNA与无复发生存
所有45例患者均纳入RFS分析，随访期间有32个RFS事件。Kaplan-Meier分析显示不同血清HBV pgRNA组之间的RFS存在显著差异（log-rank P<0.001；图5B）。以BLQ为参考，HIGH组在单变量分析中具有更高的RFS事件风险（HR=5.63，95% CI 2.15–14.74；P<0.001），而LOW与BLQ无显著差异（HR=1.64，95% CI 0.67–4.00；P=0.278）。调整肿瘤大小后，HIGH仍与较差的RFS相关（校正后HR=3.51，95% CI 1.26–9.79；P=0.017），而LOW仍不显著（校正后HR=1.13，95% CI 0.43–2.94；P=0.806）。肿瘤大小也与RFS相关（校正后每增加1厘米HR=1.19，95% CI 1.05–1.36；P=0.006）。
敏感性分析支持了主要的血清HBV pgRNA发现。在调整肿瘤大小后，将HIGH与合并的BLQ/LOW组进行比较，OS的HR为4.95（95% CI 1.82–13.48；P=0.002），RFS的HR为3.35（95% CI 1.29–8.75；P=0.013）。连续建模显示，血清HBV pgRNA每增加两倍，死亡风险（校正后HR=1.16，95% CI 1.07–1.26；P<0.001）和RFS事件风险（校正后HR=1.14，95% CI 1.05–1.25；P=0.003）均增加。相比之下，可检测（LOW/HIGH）与BLQ状态对任一终点均不显著。额外调整CA19-9和/或AJCC分期并未消除HIGH组的不利关联。
调整肿瘤大小的时变模型表明，肿瘤组织pgRNA每增加两倍的不利关联在术后早期最强，并随时间减弱（时间交互作用P=0.018（OS）和0.010（RFS））；在12个月时，估计的HR为OS 1.27（95% CI 1.01–1.61；P=0.045）和RFS 1.27（95% CI 1.05–1.54；P=0.016）。癌旁非肿瘤组织pgRNA在单变量模型中与OS相关，但调整肿瘤大小后不显著。
研究背景
乙肝病毒感染仍是全球公共卫生问题，全球约有2.54亿慢性感染者，每年导致约110万人死亡，主要死因为肝硬化及肝细胞癌；目前以核苷（酸）类似物（NA）为主的抗病毒治疗存在长期用药可能引发耐药和经济负担等局限。因此，寻找能够有效评估疗效、指导治疗调整的生物标志物至关重要。近年来，血清HBV RNA作为反映cccDNA转录活性的指标受到关注，因其在HBV DNA转阴后仍可能持续存在，显示出在监测疗效、指导停药及预测复发方面的潜力。在此背景下，北京大学人民医院联合北京大学基础医学院发表在BMC Gastroenterology上的最新研究旨在探索NA治疗期间HBV RNA的动态变化及其与HBV DNA、HBsAg的相关性，并评估其对病毒学应答和HBeAg血清学转换的预测价值，以推动HBV RNA成为临床实用的生物标志物。
研究方法
2020年至2024年间，来自中国九家医院的427名初治HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者被纳入研究。在24个月的核苷（酸）类似物治疗期间，分析了纵向HBV RNA-DNA-HBsAg相关性。评估了其对12个月时病毒学应答和24个月时HBeAg血清学转换的预测性能。
研究结果
HBV DNA、HBV RNA、以及HBsAg在治疗过程中水平均呈现下降趋势，HBV DNA下降最快，HBV RNA次之，HBsAg下降最缓慢。HBV RNA 的中位水平在基线、12 个月和 24 个月分别为6.63（4.60-7.61）、4.19（2.32-5.31） 和 2.10（2.00-3.02）log10 拷贝/mL；未产生病毒学应答患者具有更高的基线HBV DNA（中位数7.42 vs. 5.38 log10 IU/mL，）和HBV RNA（6.63 vs. 4.60 log10 copies/mL，）。
图1： 慢性乙型肝炎患者接受核苷（酸）类似物治疗后血清HBV标志物的变化。
(A) HBV DNA水平散点图。
(B) HBV RNA水平散点图。
(C) HBV DNA：HBV RNA比值散点图。
(D) HBsAg水平散点图
在HBV RNA与其他HBV血清学标志物的相关性分析中，结果显示在NA治疗前，HBV RNA与HBV DNA相关（r = 0.6380，P = 0.001），但与HBsAg无显著相关性（r = 0.1048，P = 0.0905）。在接受12个月NA治疗后，HBV RNA与HBV DNA（r = 0.5696，P = 0.0106）及HBsAg（r = 0.5196，P = 0.0010）均相关。在接受24个月NA治疗后，HBV RNA与HBV DNA的相关性消失（r = 0.6441，P = 0.0612），而与HBsAg仍保持强相关（r = 0.9167，P = 0.0005）。
对于病毒学应答（VR），12 个月的 VR 累积发生率为 49.4%（211/427）。6 个月的 HBV RNA（HR = 0.77，95% CI = 0.52–0.90，P = 0.03）、基线的HBV DNA/HBV RNA（HR = 2.51，95% CI = 1.46–4.32，P < 0.001）以及6 个月的 HBV DNA/HBV RNA（HR = 2.43，95% CI = 1.61–3.67，P < 0.001）与12 个月的 VR 相关。其中，HBV DNA/HBV RNA比值与12个月的VR最相关。
至于预测12个月的VR率以及24个月的HBeAg血清学转换率，HBV DNA的风险比为0.16（），受试者工作特征曲线下面积为0.889，而HBV RNA的风险比为0.77（），曲线下面积为0.754（表格4）。有关HBeAg血清学转换，HBV DNA的风险比为0.01（），曲线下面积为0.900，而HBV RNA的风险比为0.72（），曲线下面积为0.703，突显了它们在这个关键时间点一致的预后价值。
表格4：预测12个月发生病毒学反应（VR）及24个月发生HBeAg血清学转换的AUROC曲线
研究结论
在核苷（酸）类似物治疗期间，HBV RNA的动态变化经历了从与DNA相关到与HBsAg相关的转变。HBV DNA/RNA在6个月时的早期下降可以预测病毒学应答和HBeAg血清学转换，从而确立此时间点作为一个可靠且临床实用的早期预测点。HBV RNA补充了现有生物标志物，可用于优化慢性乙型肝炎的管理。
仁度生物自主研发的乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒，以其独特的检测技术、高灵敏性和高特异性等特点率先获准上市。区别于传统的PCR技术，本试剂盒采用独特的SAT技术，即RNA实时荧光恒温扩增扩增技术，能对RNA分子进行直接扩增和定量，不受样本中的HBV DNA干扰，无需DNA酶处理，检测下限低至50 copies/mL，搭载AutoSAT全自动平台，消除手工操作误差、节约实验室人力物力，为乙肝患者保驾护航。
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撰写：Brigette
审核：Candy
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研究结论
HBV pgRNA与HBV相关iCCA的恶性和干性相关表型有关，术前血清HBV pgRNA高水平与较差的术后生存独立相关。这些发现支持将HBV pgRNA作为HBV相关iCCA的候选感染相关生物标志物，未来需要在前瞻性多中心研究中进一步验证。
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