织密质控网络，筑牢临床蛋白队列数据防线

开展蛋白组学队列研究最怕的不是蛋白检测不足，而是测了几百上几千个样本，样本无法按照生物学分组实现有效区分，该现象大多由批次效应所导致。批次效应不能简单靠数据统计方法校正，而是实验设计阶段就用多层质控体系进行严格的分层“管控”。

批次效应从何而来

（1）色谱柱老化导致保留时间漂移、峰变宽，质谱离子源污染导致灵敏度下降。蛋白定量的差异可达20%-30%^[1-2]。

图1 色谱柱老化-保留时间漂移

（2）样本前处理，如酶解效率、除盐回收率、标记效率等都会诱发不必要的差异^[3]。

图2 酶解时间、酶的种类/批次显著影响酶切效率与最终检测结果

（3）试剂、耗材、流动相等的更换；仪器连续运行过程中，离子化效率、传输效率的变化可能都会引入系统性偏移^[4]。

图3 仪器维护（更换色谱柱、重配流动相、清洗离子源等；图中虚线隔开）会造成肽段信号发生阶跃式系统偏移，同时无维护阶段随进样累积存在信号连续漂移

（4）样本本身的特性，如冻融次数、采血后到离心的时间、溶血、脂血程度，这些都会在无形中引入偏差^[5]。

图4 血液样本前处理时间不同会影响最终检出结果

(A) 全血室温放置96h后离心，与30min内离心样本相比；(B) 全血37℃放置96h后离心，与30min内离心样本相比

诺禾致源校正方案

为保障定量结果的稳定性、可比性与可靠性，诺禾致源构建了五层递进式蛋白组全流程质控体系，覆盖从检测到分析全维度。

诺禾致源质控第一层：HeLa细胞质控，监控仪器性能的稳定性

每天一针HeLa标准细胞系样本，从实验开机到关机全程"体检"。仪器灵敏度、质量精度、色谱分离一旦飘移，当天立刻发现、当天校准，可第一时间发现并校准仪器灵敏度、质量精度、色谱分离的漂移问题，从仪器端避免非生物学因素导致的数据波动。

诺禾致源质控第二层：MixQC，监控质谱的长期进样漂移

MixQC由队列全部样本等量混合制备，可代表队列整体样本特征。

长期漂移监控：序列中周期性穿插MixQC样本，评估项目整体数据稳定性；

跨批次归一化基准：依托MixQC定量结果，完成批次内、批次间数据归一化校正。

诺禾致源质控第三层：桥接样品，跨批次校正

于不同批次间插入桥接样本作为数据锚点，对齐多批次定量数据。即使项目跨度数月、分多批次上机，可实现绝大多数数据校正至统一基准，保可有力支撑跨队列、跨中心数据可比。

诺禾致源质控第四层：批内批间双级校正，队列数据整齐可比

为了解答“差异到底来自生物学，还是来自批次"这一问题，搭建科学的校正体系是非常关键的。诺禾把校正拆成两级、层层兜底：

批内校正：以MixQC为锚，对同一次上机的所有样本做归一化与系统偏差校正，让同一批样本之间的波动只反映生物学真实差异。

批间校正：以MixQC为公共标尺，跨板、跨天、跨批次对齐定量基线，消除整体偏移，让所有样本落在同一条定量起跑线上。

诺禾致源质控第五层：NovoQC全程监控，每一针都有“标尺”

NovoQC 为诺禾自研标准品，伴随血清/血浆类项目全流程上机。作为评估仪器状态的基准标尺，保障项目稳定、可靠开展。

图5 校正前后的数据对比

完善的临床蛋白队列质控是一套系统性质量防护网络。诺禾致源搭建的这套递进式质控框架覆盖仪器性能评估、上机监测、跨批次数据校正与项目全程基准校验，可实现对蛋白组多来源技术偏差的持续监控与校正，有效降低批次效应影响，为临床大队列蛋白质组学研究提供稳健的定量数据支撑。

参考文献：

[1] Tsantilas KA, Merrihew GE, Robbins JE, Johnson RS, Park J, Plubell DL, Canterbury JD, Huang E, Riffle M, Sharma V, MacLean BX, Eckels J, Wu CC, Bereman MS, Spencer SE, Hoofnagle AN, MacCoss MJ. A framework for quality control in quantitative proteomics. bioRxiv, 2024, 04(12): 589318.

[2] Shen R, et al. IonStar enables high-precision, low-missing-data proteomics quantification in large biological cohorts. PNAS, 2018, 115(21): E4768-E4777.

[3] Scott J. Walmsley, Paul A. Rudnick, Yuxue Liang, Qian Dong, Stephen E. Stein, Alexey I. Nesvizhskii; Comprehensive Analysis of Protein Digestion Using Six Trypsins Reveals the Origin of Trypsin As a Significant Source of Variability in Proteomics. Journal of Proteome Research, 2013, 12(12): 5666-5680.

[4] ?uklina J, Lee CH, Williams EG, Sajic T, Collins BC, Rodríguez Martínez M, Sharma VS, Wendt F, Goetze S, Keele GR, Wollscheid B, Aebersold R, Pedrioli PGA. Diagnostics and correction of batch effects in large-scale proteomic studies: a tutorial. Molecular System Biology. 2021, 17(8):e10240.

[5] Hassis ME, Niles RK, Braten MN, Albertolle ME, Ewa Witkowska H, Hubel CA, Fisher SJ, Williams KE. Evaluating the effects of preanalytical variables on the stability of the human plasma proteome. Analytical Biochemistry, 2015, 1(478):14-22.