ADC精准研发利器：B6RG-Ces1c-KO 模型，破解 VC-PAB-linker ADC 的 PK/PD 评价偏差

在ADC药物研发领域，VC-PAB（Val-Cit-PAB）可裂解连接子凭借PEG亲水间隔臂带来的水溶性改善、循环稳定性提升及DAR均一性优化，已成为ADC的主流设计。然而，大量临床前数据表明，VC-PAB-linker型ADC在常规小鼠模型中系统性偏离临床真实表现：数据重复性差、PK 暴露波动显著、抗肿瘤药效偏低、毒性特征失真等。这一偏差的根源并非ADC分子本身，而是小鼠特有的Ces1c羧酸酯酶对VC-PAB motif的胞外水解，叠加异种移植背景下的免疫干扰，共同造成了转化预判失真。

图1. ADC药物的结构和特征

当前公认的高精度评价路径为：免疫缺陷背景+Ces1c敲除+VC-PAB-linker结构适配性验证+标准化PK/PD体系。

启辰自研B6RG?Ces1c?KO三基因编辑小鼠，同步消除Ces1c水解与异种免疫排斥两大物种特异性干扰，使VC-PAB?linker ADC的体内PK/PD特征更贴近非人灵长类及人体水平，有效缩小临床前研究与临床真实响应之间的转化鸿沟，提升临床转化的预测精准度。

一、问题根源：Ces1c羧酸酯酶降解与免疫干扰的双重失真

VC-PAB-linker是新一代ADC的核心结构：聚乙二醇柔性亲水间隔臂解决了传统连接子水溶性差、聚集率高、DAR不均一的问题，同时撑开空间位阻、屏蔽抗体本体干扰，显著提升ADC的循环稳定性与靶向性，也是目前多款上市ADC的主流设计。

图2. VC-PAB-linker结构示意图

第一重干扰来自Ces1c羧酸酯酶。在人与非人灵长类血浆中不存在过量酯酶干扰，VC-PAB链形成稳定水合层，保护内部Val-Cit 等可裂解肽段，实现血液中稳定循环、肿瘤溶酶体内定点释药。小鼠体系则不同：Ces1c是啮齿类特有的血浆高分泌羧酸酯酶，可识别并切割 VC-PAB-linker的肽键与酯键骨架，而VC-PAB亲水间隔臂会适度暴露酶切位点，反而成为Ces1c的结合靶点，加速ADC在血液中非正常裂解。

第二重干扰来自免疫背景。为承载人源CDX/PDX肿瘤，实验必须使用免疫缺陷小鼠以规避异种排斥；常规NOG/NSG免疫缺陷品系，具有补体缺陷、巨噬细胞和树突状细胞功能受损等天然免疫缺陷特质；与临床免疫环境不匹配，可能造成ADC药物药效失真、实验重复性差。

两重干扰叠加，使数据失真呈现为系统性偏差：

PK层面：药物暴露量下降、半衰期偏短、清除率异常，药代曲线偏离临床真实水平。

PD层面：抗肿瘤药效被低估、脱靶毒性被高估，优质候选分子被误判淘汰。

核心结论：VC-PAB-linker ADC的小鼠实验失真，是Ces1c介导的物种特异性水解与天然免疫缺陷叠加的结果，而非连接子设计或ADC分子本身的缺陷。

二、解决方案：B6RG-Ces1c-KO的三基因编辑小鼠模型

两条失真路径分别对应代谢与免疫两个层面，因此解决思路是在同一品系上把它们同时关闭：

启辰自研的B6RG以C57BL/6为遗传背景— Rag2/Il2rg双基因敲除，T、B、NK 细胞完全缺失，巨噬细胞和树突状细胞等天然免疫细胞／功能得以保存、PDX成瘤率高、实验重复性强。

在B6RG基础上再敲除Ces1c，得到B6RG-Ces1c-KO三基因编辑模型：一端阻断VC-PAB-linker的酶解通路，一端保留补体/巨噬细胞/树突细胞等天然免疫功能。在NOG小鼠上失真的两条路径，在B6RG-Ces1c-KO小鼠上同时被修复。

纯C57BL/6背景的现实价值在于：C57BL/6来源的肿瘤细胞系、同源移植瘤与PDX均可在同一品系上完成建模与评价，不必在NOD与C57BL/6两套遗传背景之间来回切换。

图3. B6RG-Ces1c-KO三基因编辑小鼠构建路线图

三、层层验证：从免疫底盘到三基因纯合品系

底盘定型：以B6RG（C57BL/6背景，Rag2、Il2rg 双敲除）为免疫底盘，确认T、B、NK细胞缺失等免疫缺陷特征。

Ces1c敲除：在B6RG基础上完成Ces1c基因编辑，关闭小鼠血浆羧酸酯酶的VC-PAB-linker水解通路。

纯合固定：通过多代繁育与基因型鉴定，把Rag2、Il2rg、Ces1c三个位点固定为纯合，并核查遗传背景一致性：

1、蛋白水平以Western blot确认Ces1c缺失；2、细胞水平以流式分析确认免疫细胞缺失；3、功能水平以血清孵育与体内PK/PD确认无降解、无免疫清除。

构建与验证同步推进，确保品系可稳定扩繁、批次间表现一致。

四、验证数据：从蛋白、细胞到功能水平研究

验证沿“蛋白—细胞—功能—体内PK/PD”逐层展开，每一层都以野生型或常规免疫缺陷小鼠为对照，形成可追溯的证据链。

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蛋白水平｜肝、肾、脑组织中

Ces1c表达缺失

Western blot显示，B6RG-Ces1c-KO小鼠肝、肾、脑组织中的 Ces1c蛋白条带消失；野生型与杂合子小鼠条带清晰，敲除效果在主要器官中一致。

图4. 不同基因型（野生型、杂合、敲除）小鼠肝、肾、脑组织中Ces1c蛋白表达。

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细胞水平｜T、B、NK细胞完全缺失

流式检测外周血（PBCs） 显示，B6RG-Ces1c-KO小鼠B细胞（IgM阳性）由35.6%降至0.2%，T细胞（CD3阳性）由21.0%降至0.5%，NK细胞（NK1.1阳性）由4.5%降至0.5%，与常规C57BL/6小鼠形成鲜明对比。

图5. 外周血免疫细胞表面标记表达：B6RG-Ces1c-KO小鼠与C57BL/6对照。

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功能水平｜血清中的VC-PAB-linker

结构得以保留

含VC-PAB-linker的ADC与小鼠血清共孵育后，野生型小鼠血清中ADC保留率在168h降至约30%（左）；Ces1c敲除小鼠血清中延长至336h仍接近100%（右）。B6RG-Ces1c-KO 血清中ADC与总抗体两条曲线基本同步，未见连接子水解导致的ADC提前解离（右图蓝、绿线）。

图6. 含VC-PAB-linker的ADC与总抗体量在小鼠血清中的稳定性。左：野生型血清（0–168h）；右：B6RG-Ces1c-KO血清（0–336h）。

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功能水平｜体内 PK｜暴露曲线趋近

临床相关物种

以VC-PAB-linkerADC在B6RG-Ces1c-KO小鼠体内开展药代评价，ADC与总抗体在0-680h内同步衰减，未见野生型小鼠中常见的暴露量骤降与清除率异常。

图7. VC-PAB-linkerADC在B6RG-Ces1c-KO小鼠体内的药代动力学曲线（总抗体TA与ADC，0–680h）。

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功能水平|体内PD|抑瘤效果

可被真实还原

在移植瘤模型中，含VC-PAB-linker的ADC 给药后21天肿瘤体积维持在基线附近，而溶剂组（蓝）与裸抗体（绿）组分别增长至约900与670mm³，VC-PAB修饰带来的成药性增益得以真实呈现。

图8. 3D4V3系列ADC对B6RG-Ces1c-KO小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用（给药后0–21天）

五、核心技术总结与应用前景

模型精度决定数据可信度，数据质量决定临床成功率。

启辰自研B6RG?Ces1c?KO三基因编辑小鼠基于C57BL/6遗传背景，实现Rag2、Il2rg、Ces1c三基因纯合敲除：一方面构建深度免疫缺陷表型，支持CDX、PDX人源肿瘤稳定定植；另一方面消除血浆Ces1c羧酸酯酶活性，规避VC-PAB?linker在循环中非正常裂解。该模型抹平啮齿类与人和非人灵长类之间的代谢差异，获得可量化、可用于申报的PK/PD实验数据，降低临床转化误判风险。

如果您正面临VC-PAB?linker型ADC临床前评价的相关困扰：常规小鼠模型PK数据波动大、药效被低估、脱靶毒性假阳性高，实验结果与非人灵长类、临床预期差异大，难以获得可用于申报的可靠PK/PD数据，欢迎联系我们，我们可为您提供B6RG?Ces1c?KO模型及配套ADC完整评价解决方案。

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