BD AbSeq在单细胞研究中的应用

Hello，小伙伴们，假期过得开心么？欢乐的时光总是短暂的，掐指一算，大家又重新回到了科研生活中了吧，今天由小编固定给大家分享单细胞方面的研究。对于单细胞的研究，大多数小伙伴主要接触和使用的是转录组。一是由于单细胞转录组商用化方案比较多，第二是基于转录组的研究文献比较多，也对自己的研究提供了很大的参考。当然，除了单细胞转录组之外，还要很多不同的组学也逐渐加入单细胞豪华套餐，例如研究表观的单细胞ATAC、单细胞甲基化，研究基因组的单细胞重测序等。今天我们给大家介绍是由 BD Rhapsody推出的BD AbSeq单细胞蛋白表达分析系统。BD AbSeq通过使用寡核苷酸偶联抗体（Ab-oligos）与细胞进行孵育，并特异性的与细胞膜表面蛋白结合，AbSeq中的每个抗体克隆与独特的寡核苷酸偶联，这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码（ABC），对ABC进行测序，可用来估计蛋白质表达的丰度。图1：BD AbSeq工作流既然可以在一次实验中完成mRNA和蛋白的定量，那么科研人员对于细胞状态的探究自然是更加的方便与效率的。从产品推出以来，已经有多个研究中使用了该技术，覆盖细胞图谱，肿瘤异质性等多个方向。接下来，我们为大家整理一些文献，分享该技术的应用：在2021年11月于《Nature Immunology》发表的《Single-cell proteo-genomic reference maps of the hematopoietic system enable the purification and massive profiling of precisely defined cell states》，作者整合生成了人类血液和骨髓的高密度单细胞蛋白-基因组参考图谱，将多达197个表面标记物的表达与健康衰老和白血病中所有主要造血细胞类型的细胞身份和生物过程定量联系起来。在该文中，作者收集了三名年轻健康捐献者、三名老年健康捐献者和三名急性髓系白血病 (AML) 诊断时患者的 BM（骨髓），对于来自健康供体的样本，富集CD34+细胞，以便能够对 HSC 分化进行详细研究。对于来自 AML 患者的样本，在某些情况下富集了 CD3+细胞，以确保T 细胞的充分覆盖。接下来作者使用BD Rhapsody平台进行了WTA或TTA测序，同时作者设计了97–197 寡核苷酸抗体标记对细胞的蛋白进行定量。在主要参考数据集中，作者结合 RNA 和高参数表面蛋白信息对 70,017 个高质量 BM 细胞进行了分析，每个细胞平均检测到约 7,500 个表面分子。经过跨实验和测量方式的数据整合，作者确定了 45 种细胞类型和细胞阶段，涵盖了之前描述的 BM 和外周血 (PB) 的绝大多数造血细胞类型，包括 CD34+ 亚群中 HSC 分化的所有阶段，所有来自于CD3+和CD56+亚群的T 细胞和自然杀伤（NK）细胞群，CD33+亚群的几个树突状细胞和单核细胞亚群以及CD10+、CD19+和CD38high亚群的所有主要B细胞分化状态。此外，还涵盖了特征不明确的亚群，例如细胞毒性 CD4+ T 细胞和间充质干细胞或基质细胞 (MSC)。来自年轻和老年 BM 的细胞在所有个体中都具有相同的细胞状态，而 AML 中的细胞状态不同。基于RNA 和表面蛋白信息的组合提供了更高的分辨率，并揭示了仅通过单个数据层无法轻易识别的细胞类型。图2：细胞分群及mRNA-蛋白表达在文章中，作者特别分析了健康衰老和癌症中的表面蛋白的表达，作者通过比较年轻和老年健康个体的 BM Abseq 数据发现不同年龄组的所有 BM 群体的表面分子表达高度相似（图 3a、b），这表明表面蛋白表达模式出乎意料地稳定且高度调控，仅受衰老的轻微影响。虽然细胞类型频率也仅受到衰老的适度影响，但观察到细胞毒性效应 CD8+ T?细胞的大量积累。此外，几种免疫调节分子的表达显示出与年龄相关的表面表现变化，包括死亡受体FAS（CD95）、脊髓灰质炎病毒受体（CD155）和ICOS配体（CD275）（图4b）。特别是，幼稚CD8+和CD4+T细胞亚群表现出与衰老相关的CD27表面表达下降，CD27是产生和维持长期T细胞免疫所需的共刺激分子（图3b，c）。总之，这些分析表明，表面蛋白表达的总体模式在健康衰老过程中基本维持一致。接下来，作者探索了 AML 中的表面标志物重塑，AML是一种血癌，其特征是不成熟、功能失调的骨髓祖细胞（也称为原始细胞）的积累。虽然健康捐献者的细胞 BM 在6个个体中表现出高度相似的拓扑结构，但对 3 名 AML 患者的初步分析表明，白血病细胞显示出患者特异性的改变（图2b）。作者额外生成了总共 15 名 AML 患者的单细胞蛋白质-基因组数据集，涵盖6名t(15;17)易位急性早幼粒细胞白血病和 9 例具有 NPM1 突变的正常核型 AML，其中 4 例患者携带额外的 FLT3 内部串联重复。虽然这些数据的无监督整合主要突出了患者之间的差异，但将细胞投影到健康参考上可以精细绘制白血病细胞的分化阶段（图 3d）。根据分化阶段的相对丰度对患者进行无监督的聚类，揭示了三个主要类别：“单核细胞AML”， 显示出具有经典单核细胞表型的原始细胞的广泛积累，急性早幼粒细胞白血病，其在早幼粒和晚幼粒细胞状态下被阻断，以及“未成熟AML”显示出大量类似HSC的未成熟成纤维细胞，多能祖细胞（MPP）、早期淋巴髓系祖细胞和早期早幼粒细胞状态（图 3e、f）。一般来说，白血病细胞保留了许多特征，对应了它们被阻止的细胞阶段。因此，差异表达分析表明，许多区分不同AML状态的表面标记也标记了其相应的健康对应物，例如未成熟AML的CD133或单核细胞AML的CD14和CD11b（图3g）。这也可以转化为潜在药物靶标的差异表面表达，例如 PD-L1 (CD274) 和 CTLA4 (CD152)（图 3h），提示AML的骨髓分化程序可能在靶向免疫疗法的治疗选择中至关重要。相反，AML和来自同一分化阶段的健康细胞之间的差异分析揭示了白血病细胞中特异性过表达的标志物（图3i）。有趣的是，基于这些分析很容易确定了几种先前描述的白血病干细胞标志物，包括CD25、Tim3、CD123和CD45RA33，支持了作者方法的有效性。通过量化每种标志物的患者间异质性程度，同时考虑细胞状态，显示许多已知的白血病干细胞标志物在患者之间的表达差异很大（图3i）。通过上述方法和研究也展示了单细胞蛋白水平的精确度以及疾病与健康组在蛋白表达水平上的差异。图3：表面蛋白表达在健康衰老和癌症中的适应性当然对于只关注特定的基因和蛋白的表达，则不需要进行全转录组测序，这样既可以节约成本，又过滤了无效信息。例如2020年发表于《Cell Reports》的《A Targeted Multi-omic Analysis Approach Measures Protein Expression and Low-Abundance Transcripts on the Single-Cell Level》，作者收集了来自三名携带HLA-A*02:01等位基因的健康对照受试者的外周血单核细胞，作者基于流式分选到tetramer-positive CD8+ T 细胞和CD45+的淋巴细胞。为了减少批次效应，作者使用了cell-hashing的技术对三个样本进行标记后混合， 其中scRNA-seq采用靶向方法，重点关注 492 个免疫相关转录本（397个预先定义的目标，辅以95个实验特定目标），AbSeq测定了41个表面蛋白。最终测得27258个细胞，这些细胞均匀分布在三个不同的供体中（供体1:8984细胞，供体2:8956细胞，供体3:9318细胞）。作者比较了流式与Abseq的结果，显示两个不同的数据集中，所有细胞群体的出现频率都相当（图4）。图4：寡核苷酸标记抗体探针与流式的比较在评估了Abseq的有效性后，作者利用了多组学分析鉴定典型记忆T细胞亚群，同时分析了罕见抗原特异性CD8+T细胞。首先，作者对来自三位独立病患的外周血单个核细胞（PBMCs）的总CD45+细胞进行了蛋白质和RNA数据进行了可视化，绘制了分别针对不同病患的UMAP图。作者发现，来自不同献血者的细胞在UMAP图上相互交织，并且更倾向于按细胞类型分离，而不是按献血者分离，这表明没有单一献血者驱动的细胞簇（图5A，左图）。另外，两个实验批次（芯片）在UMAP图上，无论是基于转录本还是蛋白质计算，均没有显示出明显的分离情况（图5A，右图）。值得注意的是，在转录产生的UMAP图上叠加蛋白质信息，可以准确识别所有主要的免疫细胞群体（图5B），而使用相应的谱系标记的转录信息则未必能实现这一点。这一点可以通过双轴图展示蛋白质信号（y轴）和转录信号（x轴）来说明（图5C）。尽管在大多数细胞中，CD8A的转录和蛋白质是共表达的，但只有一半的CD4蛋白阳性细胞（全文简称为CD4-P）含有可检测到的CD4转录。相反，作者在大量CD8+T细胞中检测到了CD69-RNA（绘制在x轴上），但正如预期的那样，外周血中只有少数CD8+T细胞表达CD69蛋白（CD69-P，绘制在y轴上）。对于CD27，作者观察到转录和蛋白质之间更高的相关性（图5C）。总的来说，基于这些观察结果，可以说明同时测量蛋白质和转录对于准确研究T细胞生物学的重要性。接下来，作者使用SCAMP对CD8+T细胞（由表面蛋白表达定义）进行了进一步分析，基于转录信息进行降维聚类可以划分成5个不同的细胞簇（图5D），通过对这些亚群的差异基因进行可视化显示，这 5 个簇代表了典型的幼稚 T 细胞群体和记忆 T 细胞群体，此外，作者的数据还允许识别表达高水平Interleukin-18 Receptor Accessory Protein (IL18RAP)和Tumor Necrosis Factor (TNF)的CD8+粘膜相关固有T（MAIT）细胞。作者通过表面蛋白表达验证了这些细胞群体的相似性（图5F），其中中心记忆CD8+T细胞表达较低水平的CD45RA蛋白，并且CD27和CD28蛋白的水平较高。重要的是，通过仅分析转录，无法区分CD45RO和CD45RA的剪接变体，突显了蛋白质和转录相结合分析的附加价值。为了可视化多组学数据中转录和蛋白质表达之间的对应关系，作者采用了One-SENSE方法，该方法最初是为了可视化质谱细胞学数据而开发的。首先作者分别将蛋白质和转录分别映射到单个UMAP图上，并且合并显示了蛋白质表达谱（x轴）和差异表达基因转录表达谱（y轴）。热图中的黑色区域指的是One-SENSE图中不包含细胞的区域。这种方法可以轻松识别类似于转录但可以由蛋白质分离的细胞簇，反之亦然（图5G）。图3G中突出了一个例子（红框和箭头），在此例中，簇2（浅绿色，TEMRA细胞）在转录上相对均匀，但可以通过CD56蛋白质表达分离。簇1（深蓝色，效应记忆CD8+T细胞）和簇2（浅绿色，TEMRA）之间的一部分细胞具有相同的蛋白质特征，但可以通过GNLY和GZMH的表达来区分。为了确定定向转录组学是否适用于研究罕见特异抗原的T细胞群体，作者对识别HLA-A*02限制的EBV表位YVLDHLIVV的CD8+T细胞进行了分析。在UMAP图上的可视化显示，所有三位献血者中的EBV特异T细胞非常相似（图5H），其中大多数细胞聚集在效应记忆CD8+T细胞簇内。然而，与EBV非特异记忆T细胞簇相比，EBV-Tet+T细胞显示Granulysin转录的显著下调，以及YBX3的上调。YBX3是一种RNA结合蛋白，其在T细胞中的功能尚未被定义，但最近的研究显示它是特定mRNA稳定性的关键调节因子。总的来说，这些数据表明，通过测序对靶向转录组学和蛋白质表达进行结合分析是研究T细胞亚群的有效方法，可以作为一种有效的工具来研究人类疾病中的T细胞应答。图5：多组学靶向转录组学鉴定典型记忆 T 细胞群并且可研究罕见特异抗原的CD8+T细胞单细胞RNA测序和AbSeq的联用为研究细胞的功能和表达提供了强大的工具，相信在多组学研究火热的当下，会有更多的应用！专题讲座预约(需求和疑问请您备注)登录优宁维官网有相应的产品链接、知识分享、经典案例分析和优惠活动哦！（www.univ-bio.com）免费电话：4008-168-068咨询邮箱：info@univ-bio.com微信公众平台：优宁维科学仪器，欢迎关注！优宁维学术中心，欢迎搜索上海优宁维生物科技股份有限公司文字来源|阿几图文编辑|居居审核|伟伟