PROTAC狙击CDKs：均相技术带你见证‘猎杀’时刻

细胞周期蛋白是与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)结合的调节亚基，从而激活激酶并控制其活性。大多数CDKs与特定的周期蛋白形成复合物，并参与细胞周期或转录的调节。CDK1、2、4和6参与细胞周期的调控，而CDK7、8、9和11在转录调控和RNA加工中起关键作用(图1)。CDKs的失调已被发现是肿瘤发生的主要驱动因素，CDK9是癌症治疗的一个有吸引力的靶点，因为它在转录调节中起着至关重要的作用，特别是短效的抗凋亡蛋白，如MCL-1和XIAP，它们对癌细胞的存活至关重要。抑制CDK9激酶活性或降解蛋白质本身是目前癌症研究中的策略之一，而特异性降解CDK9的方法之一是使用蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)。图1. 细胞周期蛋白- CDK复合物在细胞周期中的作用本文研究了靶向CDK9的PROTAC分子Thal-SNS-032在两种不同细胞HeLa和MCF-7类型中的作用，并将其与PROTAC分子的单独组分（SNS-032, Thalidomide）进行比较，以证明降解的特异性。本研究使用HTRF?和AlphaLISA?SureFire?Ultra?两种均相方法用于测量细胞中的蛋白质水平，另外测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为药物处理后整体蛋白水平潜在变化的内参。HTRF原理HTRF是一种均相的时间分辨荧光免疫分析技术，它将标准荧光共振能量转移(FRET)技术与时间分辨测量相结合，消除了短暂的背景荧光。对于夹心试验，使用两种识别目标蛋白质的抗体，其中一种抗体与供体偶联，另一种与受体偶联。如果两种抗体识别分析物，供体将在激发时发出荧光，能量将转移到附近的受体，从而产生特异性的长寿命受体荧光(图2)。图2. HTRF实验示意图 Alpha试验原理AlphaLISA是一种基于微珠的均质免疫分析平台，具有简单，简化的工作流程，可检测和定量简单和复杂样品类型中的生物分子。Alpha检测需要两种珠型:供体珠和受体珠。在680 nm的光照下，供体珠产生单线态氧。单线态氧在溶液中可扩散约200nm。如果一个受体珠在这个距离内，能量被转移到受体珠上，从而产生光。如果一个受体珠不是在供体珠附近，很少或没有信号产生的背景(图3)。图3. AlphaLISA SureFire Ultra 实验示意图案例分享1.Thal-SNS-032可快速降解CDK9用1μM CDK9 PROTAC分子Thal-SNS-032处理HeLa细胞，对照化合物进行平行试验，以测量它们对CDK9水平的影响。在图4中看到PROTAC分子Thal-SNS-032在4小时后对HeLa细胞中CDK9水平的强烈影响，导致HTRF信号(HTRF Ratio)减少约80%。CDK9抑制剂TSNS-032或CRBN结合剂沙利度胺单独使用时，用HTRF测量CDK9蛋白水平几乎没有变化。为了验证CDK9降解的特异性，测定GAPDH作为内参。图4显示GAPDH信号没有变化。这表明Thal-SNS-032引起的CDK9信号丢失是由于CDK9的靶向降解，而不是HeLa细胞裂解液中整体蛋白水平的变化。图4. 总CDK9和GAPDH HTRF测定在HeLa细胞中独立进行相同的实验，评估CDK9 PROTAC分子Thal-SNS-032与对照化合物的作用，并使用AlphaLISA?SureFire?Ultra?技术检测细胞裂解液。图5显示，在HeLa细胞中，Thal-SNS-032作用4小时后，Alpha信号损失约95%。图5. 总CDK9和GAPDH AlphaLISA SureFire Ultra测定有趣的是，当细胞用CDK9抑制剂SNS-032处理并通过AlphaLISA SureFire Ultra测量时，CDK9 Alpha信号丢失约15%。这可能是由于本实验中所见的靶标抑制导致CDK9蛋白下调所致。GAPDH水平再次不受影响，这表明CDK9水平的变化是有针对性的，而不是由于HeLa细胞中4小时总蛋白浓度的变化。2. Thal-SNS-032在两种细胞中以纳摩尔剂量降解CDK9为了进一步评估Thal-SNS-032的效力，在HeLa和MCF-7细胞中处理4小时的剂量反应试验。CDK9和GAPDH水平通过HTRF和AlphaLISA SureFire Ultra技术在两个独立的实验中测量。图6显示了根据信号退化曲线计算的半最大退化值(DC50)的HTRF结果。Thal-SNS-032降解CDK9, DC50值分别为166 nM (HeLa)和60 nM (MCF-7)， GAPDH水平无明显变化。图6 总CDK9和GAPDH HTRF测定图7. 总CDK9和GAPDH AlphaLISA SureFire Ultra测定总结CDK9是肿瘤研究中重要的蛋白靶点，因为它在许多类型的癌症中具有转录作用和频繁的失调。本研究中证明了CDK9可以在HeLa和MCF-7细胞系中被PROTAC分子Thal-SNS-032快速降解。HTRF和AlphaLISA SureFire Ultra检测技术均为均相、免洗检测模型，可提供快速可靠的结果。参考文献：1.Lapenna S et al (2009) Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer. 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