让WB数据经得起审稿人拷问！手把手演示Image J 分析标准化方法

怎么从辛苦跑出的WB条带中提取出可靠的定量数据是让许多科研人头疼的问题。今天，我们来跟大家分享使用Image J 分析Western blot实验结果的两种标准方法！

方法一：积分灰度值法

为什么要分析灰度值？

灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。然而胶片扫描后为蓝色背景+黑色条带，需要先将整张图片去色，使彩色图片变成黑白图片，形成近灰色背景+黑色条带的图片类型。条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。

此方法使用的值为积分灰度Integrated dendity，而不是平均密度值Mean gray value。因为平均灰度仅是选定区域的平均灰度数值，而积分密度值则加权了平均灰度和选定的面积，这样选择就消除了选定面积大小对灰度值的影响。

首先使用裁剪工具将图片和目标条带裁剪至合适大小（同时可以在PS中将图片进行去色处理（图片-调整-去色）），另存图片，保存到桌面。

打开Image J软件，显示下图主界面。

点击File > Open，打开裁剪过的图片文件（可以加入一个图片实例）

Image > Type > 8-bit，将图片转化为8-bit类型：避免因图片灰度级别呈指数增长，或其它颜色混入，造成计算误差。

点击Process > Subtract Background，保持默认数值为50即可，将整张图片背景灰度均一化，消除图片背景影响。

点击Edit > Invert将图片黑白颜色反转，使背景为黑色而条带为白色。既还原了条带发光时的样子，也方便我们后面框选条带。

点击Analyze > Set Measurements，并勾选面积Area、平均灰度值Mean gray value、积分灰度值Integrated dendity。

点击Analyze > Set Scale，将Unit of length中的inch改为pixels设置测量单位为“单个像素”，并定义到全部Global。

设置好后，使用矩形选框、椭圆形选框或手动绘制选框，将面积最大的条带完全圈住，快捷键Ctrl+M测量，弹出Results结果框，结果中的IntDen即积分灰度值。

继续左键点击选定框中间，不要点框线，以免选定框的大小改变(注意：显示为时可移动，显示为时会改变框的大小)，拖动选定框并移动至其它条带，快捷键Ctrl+M测量；重复操作至所有条带测完，最后不要忘了在图片无条带位置加测一个背景的灰度。

测量结束后，点击Results框中的Edit，选择Select All，粘贴至Excel，开始下一步的分析。

积分灰度值的计算和标准化

首先，将所有条带的IntDen都减去图片背景的IntDen，以扣除背景影响；然后用目标蛋白的灰度值除以其对应泳道的内参照条带灰度值，以此作为该组的目标蛋白相对表达量A。
①标准化方法：如果是用一张膜来统计，那么直接用所有组的A值除以对照组A值，此时对照组结果为1，其它组结果为对照组的倍数，以此做均一化。
②标准化方法：如果是用2张或以上的膜来一起统计，那么首先计算所有膜上的对照组A的平均值A’，然后用其它组的A值除以A’，以此做均一化。这种方法的前提是不同膜之间的背景颜色要相近，若偏差大则数据会比较乱。

方法二：光密度分析

另一种分析方法是采用波峰下面积分析条带的方法。即通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。此法应用也比较广泛、不过对条带分离度要求高。

点击File > Open，打开裁剪过的图片文件。

点击Image > Type > 8-bit，将图片转化为8-bit类型。

点击Image > adjust > Brightness/Contrast，通过拖动光标，调节图片的对比度。

点击框选工具，选中需要分析的条带。

点击Analyze > Gels > Select First Lane。

点击Analyze>Gels>Plot Lanes。

点击线性工具，划线封闭峰图。

击魔棒工具>选择要测量的峰图逐次点击就能够获得测量结果了，然后在选中数据，复制粘贴到Excel表格里，再进行分析。

上述两种方法均有较广泛的应用，而其中光密度值分析，准确度相对更高。希望今天的分享能帮助大家更好地分析WB实验结果！

点击上图或联系当地销售/技术，即可免费申领试用装

WB解决方案推荐

如需了解产品活动详情，欢迎垂询您身边的诺唯赞人~

相关耗材产品推荐