蛋白-蛋白相互作用（PPI）是调控细胞增殖、代谢、信号传导、免疫应答等几乎所有生命过程的基础。在细胞内，各类蛋白通过相互结合、调控、协作，搭建起复杂精密的互作网络，维系生命体的正常运转。

蛋白互作研究技术五花八门：免疫共沉淀Co-IP、酵母双杂交 Y2H、邻近连接实验PLA、双分子荧光互补BiFC、GST Pull-down、表面等离子共振SPR、生物层干涉技术BLI等等，这么多技术看起来很相似，到底要怎么选？不用再逐个查文献、翻资料，今天这篇笔记，汇总科研最常用的蛋白-蛋白互作研究技术，通俗易懂拆解核心知识点，清晰区分各技术的适用场景与避坑要点，帮你快速搞定PPI研究，高效推进科研实验！

想要更多实验技术的详细步骤和资料？

评论区评论“技术”，小编会联系你！

一、

检测蛋白和蛋白体内相互作用

体内检测的优点：

最接近生理真实状态；

可验证内源天然蛋白互作；

体内检测的缺点：

可能是间接互作；

实验干扰多，内源蛋白少可能检测不到；

难以检测结合亲和力和动力学

1

免疫共沉淀Co-IP

技术原理

ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠连接的靶蛋白抗体拉取内源靶蛋白，将与其结合的互作蛋白一同沉淀下来，然后通过WB检测互作蛋白；

Q

为什么ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠可以连接抗体？

A

ProteinA/G琼脂糖珠&磁珠上面偶联有ProteinA/G蛋白，ProteinA蛋白来自于金黄色葡萄球菌，ProteinG蛋白来自于链球菌，主要结合抗体的Fc区域；

简要步骤：

· 细胞裂解提取总蛋白

· 加入靶蛋白抗体孵育结合

· 加入 Protein A/G 琼脂糖珠或者磁珠结合抗体

· 离心洗涤或者磁力架洗涤去除非特异性结合蛋白

· 煮沸蛋白，WB 检测互作蛋白

核心试剂：

· Co-IP一抗（CST品牌&Starter品牌）

· WB一抗（CST品牌&Starter品牌）

· Co-IP试剂盒（Absin品牌：abs955&abs9649）

· Protein A/G琼脂糖珠&磁珠（Santa品牌：sc-2003；Cytiva品牌：17061801）

为什么选这个技术？

· 最经典内源验证，贴合生理状态；

· 技术方案成熟；

· 文献通用；

· 不需要复杂仪器；

有什么局限性？

· 只能证明体内存在相互作用，无法区分直接/间接结合；

· 易有非特异结合；

· 弱互作难检出；

· 无法检测亲和力和动力学；

· 结合强弱比较只能通过条带深浅观察，没有具体数值；

部分相关产品：

货号

名称

规格

4060S

Phospho-Akt (Ser473) (D9E) Rabbit Monoclonal Antibody

20ul/100ul

4370S

Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal Antibody

20ul/100ul

abs955

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒

50T

abs9649

免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒（磁珠法）

50T

sc-2003

Protein A/G PLUS-Agarose

2ml

17061801

PROTEIN G SEPHAROSE 4 FF, 5 ML

5ml

17127901

RPROTEIN A SEPHAROSE FF 5 ML

5ml

abs920

ECL化学发光检测试剂盒

25mlx2

2

酵母双杂交 Y2H

技术原理

把需要检测的其中一个蛋白构建至BD-载体，另一个蛋白构建至AD-载体，共同转化至酵母中。如果两个蛋白有相互作用，BD结构域和AD结构域互相靠近重新恢复转录活性，激活下游报告基因表达。

除了检测两个蛋白是否有相互作用，这种方法也常用于筛选哪些蛋白和已知蛋白有相互作用，此时需要使用酵母双杂交cDNA文库，酵母cDNA文库里面包含大量AD-未知蛋白，把已知蛋白构建到BD载体上，通过酵母双杂交进行互作筛选之后，再通过测序鉴定互作蛋白。

Q

BD和AD是什么？

A

BD和AD都是转录因子的两个结构域，BD是DNA结合域，AD是转录激活结构域，只有两者靠近才能共同发挥转录因子的作用，激活下游基因转录。

Q

下游常用哪些报告基因？

A

1、HIS3&LEU2：组氨酸合成基因和亮氨酸合成基因，这两个基因表达以后，酵母才能在缺失组氨酸和亮氨酸的培养基上生长；

2、LacZ：β- 半乳糖苷酶基因，这个基因表达之后，在含有X-gal的培养基生长时，β- 半乳糖苷酶会水解X-gal底物，生成蓝色不溶性产物，表现为菌落变蓝；

简要步骤：

· 构建 BD 和AD 质粒

· 共转化酵母感受态细胞

· 缺陷型培养基或者蓝白斑筛选阳性酵母

· 测序鉴定互作蛋白

核心试剂：

酵母感受态细胞、pGBKT7质粒（BD-质粒）、pGADT7质粒（AD-质粒）

为什么选这个技术？

· 体内生理状态；

· 适合高通量未知互作蛋白筛选，可建文库大规模筛选

· 不需要复杂仪器；

有什么局限性？

· 酵母异源表达，无高等动物翻译后修饰；

· 假阳性较高；

· 难以定量检测，无法检测亲和力和动力学；

部分相关产品：

货号

名称

规格

abs60619

快速多片段DNA无缝克隆试剂盒

50T

abs60296

小量高纯去内毒素质粒提取试剂盒

50T

abs923

预染蛋白Marker（10-245KDa）

500uL

abs60246

逆转录一管化三代预混液

100T

abs9181

GelRed核酸染料

1ml/1ml*5

3

邻近连接实验 PLA

技术原理

通过一对标记寡核苷酸(单链DNA)的抗体探针，识别待测的两个蛋白，如果两个蛋白有相互作用，两个探针之间的距离靠近，加入DNA连接酶之后会形成DNA circle。然后通过加入DNA聚合酶，进行滚环扩增；再加入荧光探针，和目标单链DNA结合，通过荧光显微镜检测是否有荧光，表明蛋白互作。

Q

什么是PLA二抗？

A

PLA二抗是共价连接有一段单链DNA寡核苷酸的抗体，可以和对应一抗特异性结合，如果两个蛋白间距小于40nm时，配对的两个PLA二抗上面的DNA可拼接环化。

Q

什么是滚环扩增？

A

使用phi29 DNA聚合酶，在37℃的条件下，围绕着环状模板进行滚环复制，恒温条件即可进行。

简要步骤：

· 样本固定和封闭

· 孵育两种靶蛋白一抗

· 加入PLA二抗

· 连接反应（加入DNA连接酶，形成DNA circle）

· 滚环扩增（加DNA聚合酶，进行滚环扩增）

· 加荧光探针，和DNA结合

·  封片，荧光显微镜观察

核心试剂：

一抗（CST品牌&Starter品牌）

PLA试剂盒（Navinci品牌）

为什么选这个技术？

· 原位检测内源互作

· 荧光可视化定位检测

· 灵敏度极高

有什么局限性？

·成本相对较高；

·无法检测亲和力和动力学；

部分相关产品：

货号

名称

规格

3287S

ROS1 (D4D6) Rabbit Monoclonal Antibody

20ul/100ul

9145S

Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) Rabbit Monoclonal Antibody

20ul/100ul

60025

NaveniFlex Cell MR RED

1 kit

60017

NaveniFlex Cell MR Atto647N

1 kit

60027

NaveniFlex Tissue MR RED

1 kit

60026

NaveniFlex Tissue MR Atto647N

1 kit

abs9170

4%多聚甲醛

500ml

abs9248

柠檬酸钠抗原修复液（50x）

100ml

abs7187

多聚赖氨酸粘附载玻片

50片

Navinci PLA特价狂欢

4

双分子荧光互补 BiFC

技术原理

和酵母双杂交类似，只不过是使用分段的荧光蛋白基因。将荧光蛋白拆成两段，一般使用YFP荧光蛋白，把需要检测的其中一种蛋白构建至带有YFP N端序列（1-172）的载体上，另一个蛋白构建至带有YFP C端序列（155-238）的载体上，然后共转染至细胞内。如果两个蛋白有相互作用，会拉进YFP两个结构域重新组装成完整的YFP蛋白空间结构，受到激发后发出荧光。

Q

N端YFP和C端YFP蛋白本身不发光

A

N端YFP和C端YFP是YFP蛋白的两个结构域，本身不发光。只有互相靠近折叠组装成完成YFP蛋白空间结构后，经激发后才会产生荧光。

简要步骤：

· 构建两段荧光标签融合表达载体

· 共转染哺乳动物细胞

· 培养表达后激光共聚焦显微镜观察荧光

核心试剂：

· YFP标签表达载体

· 转染试剂（polyplus品牌）

为什么选这个技术？

· 可视化原位互作，定性直观；

· 可确定互作亚细胞定位；

· 保持真实胞内环境；

有什么局限性？

· 荧光片段拼接不可逆，易出现假阳性；

· 难以定量互作强度

· 无法检测亲和力和动力学

部分相关产品：

货号

名称

规格

101000046

jetPRIME

1.5ml

abs60619

快速多片段DNA无缝克隆试剂盒

50T

abs60296

小量高纯去内毒素质粒提取试剂盒

50T

abs923

预染蛋白Marker（10-245KDa）

500uL

abs60246

逆转录一管化三代预混液

100T

abs9181

GelRed核酸染料

1ml/1ml*5

二、

检测蛋白和蛋白体外相互作用

体外检测的优点：

可直接证实蛋白一对一直接结合，排除第三方蛋白干扰

反应体系可控，可自由调整蛋白序列和反应环境

能精准测定结合亲和力、动力学、热力学参数

背景干扰少，实验重复性高

体外检测的缺点：

脱离细胞生理环境，缺失天然翻译后修饰与辅助因子

无法体现胞内空间定位、动态调控真实状态

1

GST-Pull Down

技术原理

诱导表达纯化GST 标签融合蛋白，固定在谷胱甘肽琼脂糖珠上，上样另一个纯化后的His标签蛋白，洗脱后WB验证蛋白结合

Q

为什么谷胱甘肽琼脂糖珠可以结合GST标签蛋白？

A

GST标签是谷胱甘肽S-转移酶，可以特异性识别和结合谷胱甘肽；谷胱甘肽琼脂糖珠表面共价偶联了谷胱甘肽配体，可以特异性的捕获GST标签蛋白；

简要步骤：

· 诱导表达纯化 GST蛋白

· 固定至谷胱甘肽琼脂糖珠

· 加入His标签蛋白体外孵育结合

· 洗涤洗脱，WB 检测结合情况

核心试剂：

· GST标签琼脂糖珠（Cytiva品牌：17075601）

· His标签琼脂糖珠（Cytiva品牌：17531806）

· GST pull down试剂盒（Absin品牌：abs50082）

为什么选这个技术？

· 直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；

· 技术方案成熟；

· 文献通用；

· 不需要复杂仪器；

有什么局限性？

· 无法体现生理状态下的互作；

· 弱互作难检出；

· 只能定性不能定量，无法检测亲和力和动力学；

· GST标签较大，可能会影响蛋白构象或蛋白结合；

部分相关产品：

货号

名称

规格

17075601

GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML

10ml

17531806

NI SEPHAROSE 6 FF 5 ML

5ml

abs50082

GST Pull Down Kit

6T

S0B1838

His tag Recombinant Rabbit mAb (S-1398-151)

25ul/100ul

S0B0271

S-RMab? GST Tag Recombinant Rabbit mAb (S-372-19)

25ul/100ul

2

表面等离子体共振 SPR

技术原理

利用表面等离子共振现象检测分子互作，芯片上两个分子结合和解离时会改变SPR角度，仪器实时记录并显示响应值信号变化；

Q

什么是表面等离子共振现象？什么是SPR角？Biacore怎样利用SPR检测蛋白互作？

A

Biacore芯片表面有一层玻璃，玻璃上有一层50nm的金膜；当一束偏振光打到芯片上时，会在玻璃-金界面发生全反射；当全反射产生倏逝波和金表面等离子体波波数相同时，会发生共振，此时反射光强度急剧下降；

在固定波长下，反射光强度降到最低时的入射角，叫做SPR角。芯片上两个分子结合和解离的过程，会改变芯片的表面质量，造成表面折射率改变，进而引起SPR角度变化。

Biacore仪器实时记录SPR角度的变化，并换算成响应值RU实时显示在屏幕上，1 RU ≈ 1 pg/mm2 质量变化；两个分子结合时，RU值随着时间上升；两个分子解离时，RU值随着时间下降；检测结束后，软件会自动计算结合亲和力，结合动力学，结合浓度等参数；

简要步骤：

· 偶联一种蛋白至传感芯片；

· 流动相依次加入梯度浓度另一蛋白，每一个梯度中间进行再生步骤；

· 实时采集结合 / 解离曲线；

· 拟合计算动力学与亲和力常数 KD；

核心试剂：

CM5传感芯片（Cytiva品牌：BR100530）

氨基偶联试剂盒（Cytiva品牌：BR100050）

纯化目的蛋白（Cytiva品牌纯化产品或者优爱品牌重组蛋白产品）

为什么选这个技术？

·直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；

·精准测定结合动力学、亲和力 KD；

·实时全程检测互作过程；

·无需标记，避免标记影响；

·超高灵敏度检测；

·互作检测金标准，数据受审稿人认可；

有什么局限性？

· 需要有Biacore仪器；

·或者找Biacore外包服务公司（优爱品牌可提供）；

部分相关产品：

货号

名称

规格

BR100530

Series S Sensor Chip CM5

3片装

BR100050

Amine Coupling Kit

1 Kit

28995056

His Capture Kit

1 Kit

BR100349

Acetate 4.0

50ml

BR100350

Acetate 4.5

50ml

BR100351

Acetate 5.0

50ml

BR100352

Acetate 5.5

50ml

BR100354

Glycine 1.5

100ml

BR100355

Glycine 2.0

100ml

BR100356

Glycine 2.5

100ml

BR100357

Glycine 3.0

100ml

BR100669

HBS-EP+ 10X

1000ml

28995084

PBS-P+ 10X

1000ml

3

生物层干涉技术 BLI

技术原理

利用生物层干涉技术检测分子互作，传感器表面两个分子结合和解离时改变光谱位置，仪器实时记录并显示光谱位移变化；

Q

什么是生物层干涉技术？怎样检测蛋白互作？

A

传感器表面有光纤探头，尖端有光学参考层+生物分子层两个反射面，当有白光射入光纤，会在两个界面分别反射，形成干涉光谱。

当探头表面有两个蛋白发生结合和解离时，传感器表面生物膜厚度和密度改变，从而反射光光程差改变，使干涉光谱波长发生位移。

仪器实时记录波长位移，转化为结合和解离曲线并实时显示在屏幕上，两个分子结合时，信号随着时间上升；两个分子解离时，信号随着时间下降；检测结束后，软件会自动计算结合亲和力，结合动力学，结合浓度等参数；

简要步骤：

· 固定一种蛋白至传感器探头；

· 依次浸入梯度浓度另一蛋白，每一个梯度中间进行再生处理；

· 实时采集结合 / 解离曲线；

· 拟合计算动力学与亲和力常数 KD；

核心试剂：

· 生物传感器；

· 纯化的目的蛋白（Cytiva品牌纯化产品或者优爱品牌重组蛋白产品）

为什么选这个技术？

· 直接证实体外直接结合，排除细胞内其他蛋白干扰；

· 精准测定结合动力学、亲和力 KD；

· 实时全程检测互作过程；

有什么局限性？

· 需要有BLI仪器；

· 灵敏度低于SPR；

· 配体固定量低于SPR；

部分相关产品：

货号

名称

规格

29091596

Superose 6 Increase 10/300 GL

1根

29148721

Superdex 75 Increase 10/300 GL

1根

28990944

Superdex 200 Increase 10/300 GL

1根

28989335

HiLoad 16/600 Superdex 200 pg

1根

17524801

HISTRAP HP 1 X 5 ML

1 X 5 ML

17525501

HISTRAP FF 5 X 5 ML

5 X 5 ML

17371201

Ni Sepharose excel 25 ml

25 ml

17531801

NI SEPHAROSE 6FF, 25 ML

25 ML

17075601

GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B  10 ML

10 ML

蛋白-蛋白互作技术总结

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