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资讯 2026年9月17日，Cell上发表了题为Spatial biology reveals altered macrophage states in immunosuppressed non-melanoma skin cancer的研究论文。该研究整合单细胞、空间转录组、多重免疫荧光与空间 ATAC-seq，对比免疫健全（IC）和免疫抑制（IS）的非黑色素瘤皮肤癌（NMSC）患者。IS 患者肿瘤微环境中 T 细胞克隆扩增与多样性降低，CD68?巨噬细胞空间分布改变，巨噬细胞、T 细胞同肿瘤细胞的互作减弱。空间表观组揭示两组存在差异化转录因子调控程序，IS 患者 CD68? TAMs 的 ATF3 信号上调，介导抗炎表型，最终导致抗肿瘤免疫功能受损。
·主要研究结果·
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ICIs和IS NMSC 患者的整体免疫细胞组成比例相似
本队列共纳入 138 例 BCC/cSCC 患者的 150 份肿瘤标本，分为 55 例免疫健全（IC，39.8%）、83 例免疫抑制（IS，60.1%）两组，包含头颈部与非头颈部病灶，开展多组学分析。生存分析显示，IS 患者预后显著劣于 IC 患者：5 年总生存率 33.3% vs 68.8%（p<0.001）。该结果表明全身免疫抑制会显著恶化非黑色素瘤皮肤癌的临床结局，亟需解析其背后的免疫致病机制。
由于免疫检查点抑制剂（ICIs）在免疫抑制（IS）NMSC 患者中的应用数据十分匮乏，借助 CD45?细胞的单细胞 RNA 测序，对比 IS 与免疫健全（IC）患者肿瘤微环境的免疫细胞组分。该队列包含 30 例患者的 36 份样本（18 例 IS，12 例 IC），共计测序 226?170 个单细胞，获得10 大类免疫细胞。尽管 IC、IS 肿瘤中均能检测到完整的免疫细胞谱系，但免疫细胞亚群的相对比例不存在统计学差异。提示二者肿瘤微环境的免疫细胞整体组成基本相近。
图1 ICIs和IS NMSC 患者的整体免疫细胞组成比例相似
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综合空间和转录分析揭示了IS NMSC中巨噬细胞景观的改变
纳入88 例皮肤鳞状细胞癌（cSCC）患者样本进行mIF分析，对肿瘤区室与基质区室的免疫细胞密度进行定量分析。结果显示，IC 与 IS 患者样本的肿瘤区室、基质区室内，CD4? T 细胞、CD8? T 细胞、B 细胞的细胞丰度均无显著组间差异；但IC 组的瘤内 CD68?巨噬细胞密度显著高于 IS 组（图 2A、2B）。上述结果提示 CD68?巨噬细胞的空间排布模式发生改变，因此进一步解析瘤内髓系细胞的微环境。利用外部队列（共 54 例 cSCC 标本，29 例 IS、25 例 IC）开展mIF检测，验证瘤内髓系细胞的组成特征（图 2C、2E）。IS 肿瘤的瘤内髓系细胞整体密度低于 IC 肿瘤。以上多队列数据共同证实：免疫抑制状态和瘤内髓系细胞（尤其是巨噬细胞）数量下降相关，IS 患者肿瘤内部髓系细胞密度显著低于 IC 患者（图 2D、2E）。
对 IC、IS NMSC 肿瘤微环境中的巨噬细胞进行亚聚类，鉴定出 6 个巨噬细胞亚群：①炎性细胞因子富集 TAM（InflamTAMs，特征基因：IL1β?IL1RN?CXCL8/3/1/2?）；②细胞外基质降解型 TAM（ECMDeg TAMs，特征基因：MMP9?SPARC?）；③脂质相关 TAM（LATAMs，特征基因：APOC1?APOE?LPL?）；④增殖型 TAM（ProlifTAMs，特征基因：MKI67?STMN?TYMS?）；⑤干扰素应答型 TAM（IFNTAMs，特征基因：CXCL9/10?IFITM1/3?）；⑥组织驻留巨噬细胞（RTM，特征基因：CD163?MS4A7?MAF?MRC1?）（图 2F、2G）。
IC 与 IS 肿瘤的巨噬细胞亚群构成存在一定差异：IS 样本中组织驻留巨噬细胞（RTM）占比相对更高，IC 样本则增殖型 TAM 占比更高（图 2H、2I）。对各个巨噬细胞亚群的差异基因进行 IPA 通路富集分析，结果显示 IS 与 IC 肿瘤之间存在通路层面的区别（图 2J、2K）。多个巨噬细胞亚群中，若干先天免疫、细胞因子相关通路在 IS 样本中 Z 评分为负值，包括 FCGR 介导的吞噬作用、IL6、IL17 以及 IL33 信号通路。但巨噬细胞激活通路并非在 IS 肿瘤中全部被抑制；部分 TAM 亚群中经典巨噬细胞激活通路 Z 评分为正值。通路富集效应在 RTM、InflamTAMs、ECMDeg/IFN 应答 TAM 亚群之间各不相同，这充分表明 IS 肿瘤微环境下，不同巨噬细胞亚群通路激活状态具有高度异质性。
图2 综合空间和转录分析揭示了IS NMSC中巨噬细胞景观的改变
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IC 与 ISNMSC 患者均存在多种 CD8?、CD4?T 细胞亚群
为明确IS中 CD68?巨噬细胞空间分布异常是否会造成 T 细胞变化，对 T 细胞开展分析。对 T 细胞进行精细亚群聚类，鉴定出多个功能各异的 T 细胞亚群（图 3）。在 CD8? T 细胞中，共鉴定出 11 个亚群，覆盖完整的 T 细胞分化谱系（图 3A、3B）。与之类似，CD4? T 细胞分析共得到 14 个功能亚群（图 3G、3H）。上述亚群共同描绘出肿瘤浸润淋巴细胞丰富的功能图谱。值得注意的是，无论是 CD8?还是 CD4? T 细胞，IC 组与 IS 组各 T 细胞亚群的细胞丰度均不存在组间差异（图 3C、3D、3I、3J）。
为从功能层面解析免疫抑制状态带来的 T 细胞异常，对 IS 与 IC 组开展通路富集分析（图 3E、3F、3K、3L）。分析显示，CD8? T 细胞中一共鉴定出 2?947 个差异表达基因。IS 样本中，细胞毒性效应通路相关基因（GZMB、PRF1、IFNG）显著下调，而 T 细胞耗竭标志物PDCD1、CTLA4、TIGIT表达上调。CD4? T 细胞同样存在 2?181 个差异基因，IS 样本呈现出调节性、免疫抑制相关程序的显著富集。IPA 通路分析进一步证实 IS 样本内多重细胞类型的抗肿瘤免疫通路被抑制：CD8? T 细胞的 “CTL T 细胞介导的细胞凋亡” 通路；CD4? T 细胞的 “Th1 通路”；髓系细胞的 “树突状细胞成熟” 通路。
图3 IC 与 IS NMSC 患者均存在多种 CD8?、CD4?T 细胞亚群
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IS?NMSC 患者肿瘤 T 细胞克隆扩增及克隆型多样性降低
接下来评估 了CD8?与 CD4? T 细胞亚群的克隆型多样性（图 4A4D）。对 IC 及 IS的 T 细胞克隆扩增水平进行综合分析发现：IS 肿瘤内高扩增的 CD8? T 细胞克隆数量显著少于 IC 肿瘤（图 4A4D）。采用多项多样性指数，对不同 T 细胞亚群的 TCR 多样性进行综合评价。相较于 IC 患者，IS 患者两大主要 T 细胞亚群的 TCR 多样性均显著下降（图 4E、4F）。
进一步分析不同 T 细胞群体之间的抗原克隆共享特征（图 4G）。在 IC 肿瘤中，CD8? T 细胞各亚群之间存在中等程度的 TCR 克隆共享：EM_GZMK与Stress_NR4A1亚群之间存在明显的克隆重叠；Stress_HSPA6、NKlike、Naive以及Mem_migratory亚群间也存在中等水平的克隆共享。IS 肿瘤虽然仍保留EM_GZMKStress_NR4A1这一组关联，但整体不同亚群间的 TCR 克隆相似度更低；其中NKlike亚群的克隆共享衰减最为突出。IS 肿瘤绝大多数 CD8? T 细胞亚群的克隆重叠普遍减弱，但仍保留部分核心的应激效应 T 细胞关联。该结果提示，在免疫抑制的 NMSC 肿瘤微环境中，TCR 受体库受到约束，与慢性免疫抑制条件下 T 细胞克隆多样化能力受限的特征相吻合。
CD4? T 细胞的克隆重叠模式与 CD8? T 细胞存在明显区别（图 4H）。IC 肿瘤各亚群间的克隆重叠程度很低，这种弱相关模式符合 CD4? T 细胞高度分区化分化、维持各自独立功能表型的特点。与之相反，IS 肿瘤的不同亚群间 TCR 克隆相似度更高：Stress_NR4A1、Stress_HSPA6、Prolif、Naive亚群之间克隆共享明显增强，并且调节性 T 细胞（Treg）内部的克隆相关性相比 IC 样本也显著升高。IS 肿瘤初始、增殖及应激相关 T 细胞亚群克隆重叠增加，说明不同激活状态下 T 细胞均以少数共有克隆为主，克隆扩增多样性不足，反映免疫抑制肿瘤微环境中 CD4? T 细胞的功能分区发生损伤。
图4 单细胞TCR测序显示IS NMSC患者肿瘤中T细胞克隆扩增和克隆型多样性降低
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免疫抑制与肿瘤微环境中免疫细胞分布及细胞互作紊乱相关
为阐明 NMSC TME 中分子与功能异质性的免疫细胞空间分布是否会诱导抗肿瘤免疫应答受损，对 45 例 cSCC 患者的 81 份样本开展Xenium空间转录组（23 份来自 IC 患者，58 份来自 IS 患者）。无监督聚类共得到 19 个 UMAP 簇,19 个 UMAP 簇中包含 8 个肿瘤相关簇（图5A）。空间图谱分析显示，基于marker注释的肿瘤区域，与病理界定的肿瘤区域高度吻合（图 5B）。鉴定出两个巨噬细胞簇（CD163?CD68?CXCL9 high、CD163?CXCL12 high）以及一个 T 细胞簇（图 5A、5B）。沿用单细胞的亚群注释结果，进一步对巨噬细胞与 T 细胞进行精细注释并生成 UMAP 图谱（图 5C）。
为解析免疫细胞如何在肿瘤内部形成空间生态位，利用单细胞空间坐标信息，在 NMSC TME 中划定空间生态位（图 5D）。与预期一致，由于 ECM-Deg TAMs 在巨噬细胞亚群中占比最高，IC、IS 两组患者的瘤内生态位均以 ECM-Deg TAMs 为主（图 5E）。在瘤内生态位中，IC 患者样本富集脂质相关 TAMs，这类巨噬细胞参与组织重塑、脂质代谢，并介导局部免疫抑制；IS 患者样本中 RTM 巨噬细胞占比呈升高趋势。上述结果提示，免疫状态不同的患者拥有以巨噬细胞为主导的差异化空间生态位：RTM 巨噬细胞可能在 IS 患者体内构建免疫抑制微环境，而脂质相关 TAMs 则反映 IC 肿瘤的代谢重编程与免疫激活状态。
为直接解析免疫细胞、基质细胞与肿瘤细胞之间的细胞互作，采用 stLearning 算法，在空间背景下进行共表达分析（图 5F–5J）。相较于 IS 样本，IC 样本中 B 细胞、脂质相关 TAMs、增殖型 TAMs 及单核细胞的细胞互作节点显著更多（图 5I）。CD4?T 细胞、CD8?T 细胞与 IFN-TAMs 的互作计数在 IS 样本中呈下降趋势（图 5I）。与之相对，肿瘤细胞以同型互作为主，肿瘤 - 免疫细胞之间的互作相对匮乏（图 5H）。为聚焦抗原呈递细胞与 CD8?T 细胞的相互作用，筛选 CD8?T 细胞占比＞20% 的生态位纳入分析，共包含 7 例 IC 样本、20 例 IS 样本。在该类生态位内，IS 样本中 ECM 降解型 TAMs、IFN-TAMs、单核细胞及 RTM 巨噬细胞占比呈降低趋势（图 5J）。该结果说明，在 CD8?T 细胞富集的空间生态位中，与 CD8?T 细胞发生互作的巨噬细胞亚群组成在 IC 和 IS 肿瘤间存在差异。综上，NMSC 的免疫抑制特征体现为：巨噬细胞、T 细胞与 TME 空间生态位内肿瘤细胞之间的互作减少，这一改变可能最终造成抗肿瘤免疫功能障碍。
图5 Xenium 单细胞空间图谱解析 NMSC 肿瘤免疫监视：IS 与 IC 患者存在迥异的空间生态位与细胞互作
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空间 ATAC 测序揭示 IC 与 IS 患者 TME 的表观遗传调控及染色质可及性差异
抗原提呈机制的表观遗传失调是癌细胞逃避免疫监测的关键机制。为阐明介导肿瘤先天免疫与适应性免疫信号串扰的表观调控机制，对 14 例 NMSC 患者（包含 cSCC 与 BCC）样本开展空间 ATAC-seq 检测，其中 IS 组 7 例、IC 组 7 例。无监督聚类共得到 12 个空间表观簇（spEP）（图 6A）。将空间表观簇映射至 NMSC 肿瘤样本上，可见肿瘤富集区与瘤周区域呈现截然不同的空间分布模式（图 6B）。对比 IS 组与 IC 组，肿瘤及 TME 相关空间表观簇的标准化占比整体无显著差异；成纤维细胞 /CD8?细胞毒性 T 细胞簇（C5）呈现独特分布特征（图 6C）。
将空间 ATAC-seq 数据集与空间转录组数据进行联合分析，共鉴定出 5 个肿瘤相关簇与 7 个 TME 相关簇（图 6A）。识别出两类巨噬细胞亚群：巨噬细胞 1富集于 C6 簇，巨噬细胞 2富集于 C7、C9 簇。同时鉴定出两个特征不同的成纤维细胞簇：成纤维细胞 1 簇富集成纤维细胞特征，常与 CD8?CTL T 细胞（C5、C8）邻近；成纤维细胞 2 簇为成纤维细胞 - 巨噬细胞混合特征，与巨噬细胞 2（C9）相伴分布。C11 簇以肿瘤细胞为主，其中 SOX15 可能兼具干性调控因子与肿瘤抑制因子的功能；C10 簇中 HOXC10 等基底细胞分化标志物的 GAS 较高；C3 簇则富集EMT标志物 SNAI2 的可及性信号。此外，在组织的瘤周区域，成纤维细胞（CDH2）、T 细胞（LAG3）、M2 型基质巨噬细胞（CD163）等基质及免疫标志物的 GAS 与 C1、C4、C5、C6、C7、C8、C9 簇相关。肿瘤细胞（KRT5）、基质成纤维细胞（PDGFRA）、TAMs（CD68）及 RTMs（CD163）特征基因的染色质可及性空间分布证实：空间 ATAC-seq 能够实现巨噬细胞在肿瘤区与基质区的空间定位，并捕捉巨噬细胞在与 TME 内其他细胞互作时，伴随产生的染色质可及性改变及其潜在调控重编程（图 6F）。
图6 空间表观组学分析揭示 NMSC 肿瘤区与基质区内存在差异化的免疫互作
为系统解析上述细胞互作模式，以及它们如何调控 NMSC 肿瘤微环境内不同空间生态位的转录特征，开展邻域分析，计算各细胞簇专属的空间共定位倾向。结果显示，癌起始细胞样肿瘤簇（C10）的同型聚类得分最高，提示该细胞簇与其他细胞簇相互作用较弱，倾向形成同型细胞构成的空间生态位。差异邻域分析证实，IS 与 IC 样本的异型细胞簇空间配对模式存在显著差异（图 7A）。在 IC 患者样本中，表观定义的巨噬细胞 2（C9）相比 IS 患者，更易与增殖型角质形成细胞肿瘤簇 1（C12）紧密相邻（图 7A、7B）；与之类似，紧邻肿瘤簇（C10/C11）的巨噬细胞 2（C7）在 IC 患者中丰度更高（图 7A）。IC 肿瘤中可高频检出一类巨噬细胞，其表观特征符合促炎、增殖、干扰素应答型 TAM：在补体基因座（C1QA/C1QC）、抗原加工相关基因座（CTSS）附近信号富集，且 II 类 MHC 基因座（HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1）转录活性升高，这类巨噬细胞大多紧邻肿瘤细胞分布。
为进一步挖掘决定免疫细胞表观状态的核心调控因子，对比分析了 IC 与 IS 样本开放染色质区的转录因子（TF）结合基序富集情况。C12 簇同时包含 CD68?TAMs 与肿瘤细胞，该簇显著富集 MAF 基序；MAF 是驱动 TAM 向免疫抑制表型极化的关键转录因子。在 IC 样本中，经表观注释的 CD68?TAMs（C12）与成纤维细胞、巨噬细胞簇 C9 紧密相邻（图 7A、7B）。与之相反，IS 样本中表观定义的成纤维细胞 1 簇（C4、C8）更常和 CD8?CTL 簇（C5）、CD8?耗竭 T 细胞簇（C2）或癌起始细胞簇（C10）空间邻近（图 7A、7B）。C8 簇富集调控 T 细胞发育分化的 TCF7 基序；C4、C5 富集 NANOG 与 E2F 基序。C1 簇富集 CUX1 基序，该因子介导基质成纤维细胞炎症应答；C7 富集 RUNX1 基序，参与调控癌相关成纤维细胞功能；C9 富集 SOX2 基序，可促进癌相关成纤维细胞介导的肿瘤生长。上述结果提示：IC 患者中，具备活跃 MAF 调控程序的巨噬细胞是 CD68?TAMs 发挥免疫调控功能的重要基础；而在 IS 患者中，一类 CUX1 高活性、表观呈促炎特征的成纤维细胞亚群，能够在空间层面调控 TCF7 阳性 CD8?T 细胞，最终造成抗肿瘤免疫功能受损。
对比了 IS、IC 两组 NMSC bulk 水平的转录因子基序富集谱：IS 样本富集 ETS、HNF4、SPI1、ETV4 基序；IC 样本富集 GRHL1、TP53、TP63、POU2F2、FOXF2 基序（图 7C）。值得注意的是，C12 肿瘤簇含有丰度最高的 CD68????巨噬细胞（图 7D）；在该簇内，IC 患者的开放染色质区域显著富集 ATF3 基序（图 7E）。ATF3 是细胞适应性应答网络的核心枢纽，参与调控促炎基因表达。空间图谱结果证实，ATF3 基序高富集区域与肿瘤富集区域重合（图 7F）。有意思的是，IS 患者 ATF3 GAS高于 IC 患者（图 7G），提示 IS 患者 CD68?TAMs 的 ATF3 信号通路激活水平上调，这一发现为阐释 IS 患者 CD68?TAMs 的抗炎表型机制提供了线索。综上，共同证明 IC 与 IS NMSC 患者 TME 中 CD68?TAMs 的空间分布模式存在明显改变。
图7 IC 与 IS 患者肿瘤微环境中存在差异化的细胞邻域关系及转录因子基序富集特征
参考文献：Shorook et al., Spatial biology reveals altered macrophage states in immunosuppressed non-melanoma skin cancer. Cell. 2026. DOI: 10.1016/j.cell.2026.07.031
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