转载自：鑫诺美迪

微卫星不稳定性（MSI）是指肿瘤组织中由于微卫星重复单元的插入或缺失导致的微卫星长度的改变。MSI是首个FDA批准用于癌症治疗的“泛癌种”生物标志物，主要用于实体瘤患者免疫检查点抑制剂治疗效果预测。此外，MSI状态还可用于肿瘤预后评估、化疗疗效预测、分子分型及林奇综合征筛查等。人基因组微卫星序列分布广泛、数目众多，约占基因组的3%。因此，如何从众多微卫星序列筛选出高灵敏度及特异性的位点，用于MSI状态的精准检测，是一项至关重要的工作。

本文基于国内外临床指南及研究，回顾MSI-PCR检测微卫星位点的筛选历程，并对不同微卫星位点的检测特点进行了分析。

1998年，美国国家癌症研究所（NCI）发布林奇综合征和MSI Bethesda指南[1]，对MSI检测位点的选择和诊断标准进行了规范和统一，推荐2B3D Panel进行MSI检测,又称Bethesda Panel或NCI Panel，包含2个单核苷酸位点（BAT-25,BAT-26）和3个双核苷酸位点（D2S123, D5S346, D17S250）。判读标准为：≥2个位点不稳定，为微卫星高度不稳定性（MSL-H）；若1个位点不稳定，为微卫星低度不稳定性（MSL-L）；若5个位点均稳定，为微卫星稳定（MSS)。

2002年，Suraweera等人发表研究成果[2]，采用Pentaplex Panel（5个单核苷酸位点：BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24），对200多例肿瘤及细胞系样本进行MSI检测，可达到100%的灵敏度和特异性，并且6例原来划分为MSI-H的样本被重新划分为MSS/ MSI-L。该研究表明，采用单核苷酸位点Panel相比NCI Panel，对于MSI检测具有更高的灵敏度和特异性。2004年，该团队对Pentaplex Panel进行升级[3]，为了避免PCR产物长度重叠，他们将NR-22替换为NR-27，即检测位点为BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27（表1）。

表1. Pentaplex Panel位点信息

2004年，NCI对林奇综合征和MSI Bethesda指南进行修订[4]，明确提出单核苷酸位点检测MSI灵敏度更高，对于仅检测出双核苷酸突变的情况，应进行单核苷酸Panel检测以排除MSI-L，并推荐Pentaplex Panel进行MSI检测。

2004年，Bacher等人通过评估266个单核苷酸、双核苷酸、四核苷酸及五核苷酸位点对MSI检测的敏感性，从中筛选出MSI检测的最优标志物，并构建了包含5个单核苷酸位点（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27）和2个五核苷酸位点（Penta C和Penta D）的MSI检测方案（表2）[5]。

表2.  Panel位点信息

2019年，中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌专家委员会等发布了《结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识》，指出PCR-毛细管电泳法是MSI检测的金标准方法，而5-7个标志位点组合BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22、NR-24、NR-27和MONO27是PCR-MSI检测的金标准位点[6]。同年，ESMO指南提出5个单核苷酸位点Panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27）具有更高的灵敏度和特异性，可用于MSI检测以指导肿瘤患者免疫治疗[7]。

2022年，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布《?微卫星不稳定性（MSI）检测试剂临床试验注册审查指导原则?》，指出在MSI检测试剂的设计过程中，需综合考虑备选位点在MSI-H患者中的阳性率、微卫星序列长度变化易读性等因素，选择适当的位点组合，并设定合理的判定标准。

2024年，《微卫星不稳定性（MSI）检测技术专家共识》推荐选用NMPA或FDA注册审批要求的试剂盒位点组合进行MSI检测，其中包含了六个单核苷酸位点的组合（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27，MONO-27），同时需增加对照位点（如Penta C、Penta D、Amel）作为内部质控，以保证结果的准确性[8]。

2025年，欧洲分子遗传诊断质量联盟（EMQN）发布了《EMQN 实体瘤微卫星不稳定性分析和报告的最佳实践指南》，建议MSI检测应使用单核苷酸位点进行MSI分析，增加对MSH6蛋白缺失检测的敏感性，分析应至少包含5个单核苷酸位点，以减少胚系变异及随机体细胞突变的影响[9]。

图1. MSI检测位点筛选历程

关于单核苷酸位点用于MSI检测的优势，在多项研究中均得到了证实。本文汇总了两项研究的结果。

研究一，来自中山大学附属第六医院进行的头对头的研究[10]，研究人员比较了3个基于PCR技术的MSI Panel在结直肠癌和胃癌患者中MSI检测的表现，分别为初代NCI Panel（2B3D）、实验室独立设计的五个单核苷酸位点Panel和六个单核苷酸位点Panel（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27，MONO-27）。该研究共纳入2178例结直肠癌（CRC）和394例胃癌(GC)患者，并同时对肿瘤样本进行错配修复（MMR）蛋白免疫组织化学检测（IHC）。结果表明，CRC患者中，初代NCI Panel与两种单核苷酸位点Panel的MSI-H检出率分别为11.0%和11.3%，在GC患者中，MSI-H的检出率分别为9.7%和9.9%，其中，两个单核苷酸位点Panel对MSI-H的检出率一致，均略高于初代NCI Panel。

研究共有15个样本存在初代NCI Panel与单核苷酸位点Panel结果不一致的情况。其中，在8例检测结果不一致的CRC患者中，结合IHC结果7例被初代NCI Panel（2B3D）误诊为MSI-L，1例被单核苷酸位点Panel误诊为MSI-L，单核苷酸位点Panel对MSI-L的误诊率显著低于NCI Panel（12.5% vs 87.5%，p=0.010），此外，有6例初代NCI Panel（2B3D）与单核苷酸位点Panel分别检测为MSI-L与MSS的患者，结合IHC结果6例均为MSS（表3）。

表3. 15例结果不一致样本的 MSI、IHC检测结果

该研究同步进行MSI-H样本中，不同微卫星位点检测突变频率的分析，在238例MSI-H结直肠癌样本和38例MSI-H胃癌样本中，单核苷酸位点不稳定性检出的平均比例为97.9%，二核苷酸位点检出不稳定的平均比例为54.9%；其中，38例胃癌样本均检测到BAT-25、NR-27，MONO-27发生不稳定（图2）。微卫星单核苷酸位点基本都为纯合状态，双核苷酸位点杂合子现象发生较多。

图2. MSI-H结直肠癌(A)与MSI-H胃癌(B)中MSI位点不稳定性比例

因此，在中国结直肠癌和胃癌患者中，5个或6个单核苷酸位点Panel相比初代NCI Panel（2B3D）检测MSI可能更具优势。

研究二，Bacher等人评估了包含单核苷酸、双核苷酸、四核苷酸及五核苷酸的共266个重复位点，评估标准包括灵敏度、特异性、稳定性及解读便捷性[5]。研究人员纳入了156例MSI-H、225例非MSI-H结直肠癌肿瘤组织样本及配对血液样本，肿瘤样本之前已通过10个微卫星位点的Panel进行MSI检测和IHC检测确定了MSI状态。通过对266个位点的检测结果进行分析表明，单核苷酸位点的平均灵敏度和特异性分别为96%和99%，均高于多核苷酸位点。同时，在MMR蛋白表达正常的非MSI-H肿瘤样本中，双核苷酸和四核苷酸位点不稳定的人群比例明显高于单核苷酸位点，而这并非人体基因组的多态性导致（表4），提示多核苷酸位点检测MSI可能会出现假阳性，因此选择稳定性高的单核苷酸位点可有效降低假阳性。此外，双核苷酸和四核苷酸位点由于高度多态性，会大大增加结果判读的难度。而单核苷酸位点在多数人中长度非常稳定，为“准单态性”位点，结果判读简单明了。最后，研究人员得出结论,本项研究进一步证实了单核苷酸位点为MSI检测的灵敏度和特异性最佳标志物。

表4. 单/双/四核苷酸位点胚系多态性及肿瘤细胞不稳定的比例

综上，单核苷酸位点用于MSI检测具有灵敏度高、特异性强、稳定性高、杂合率低、结果判读简单等优势，还可识别双核苷酸位点易漏检的MSH6缺失。BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27，MONO-27六个位点经过临床研究验证和指南推荐，可以作为MSI Panel设计的可靠选择。

参考文献

[1] C R Boland , S N Thibodeau, S R Hamilton, et al. A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res. 1998, 58(22):5248-5257.

[2] N Suraweera, A Duval, M Reperant, et al. Evaluation of tumor microsatellite instability using five quasimonomorphic mononucleotide repeats and pentaplex PCR. Gastroenterology. 2002, 123(6):1804-1811.

[3] Olivier Buhard, Nirosha Suraweera, Aude Lectard, et al. Quasimonomorphic mononucleotide repeats for high-level microsatellite instability analysis. Dis Markers. 2004, 20(4-5):251-257.

[4] A Umar, C R Boland, J P Terdiman, et al. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst. 2004, 96(4):261-276.

[5] J W Bacher, L A Flanagan, R L Smalley, et al. Development of a fluorescent multiplex assay for detection of MSI-High tumors. Dis Markers. 2004, 20(4-5):237-250.

[6]中国临床肿瘤学会结直肠癌专家委员会等. 结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识.实用肿瘤杂志. 2019, 34(5):381-389.

[7] C Luchini, F Bibeau, M J L Ligtenberg, et al. ESMO recommendations on microsatellite instability testing for immunotherapy in cancer, and its relationship with PD-1/PD-L1 expression and tumour mutational burden: a systematic review-based approach. Ann Oncol. 2019, 30(8):1232-1243.

[8]中国医师协会医学技师委员会病理技术专家组等. 微卫星不稳定性（MSI）检测技术专家共识. 临床与实验病理学杂志. 2024, 40(3):228-234.

[9]R Gallon, L McCormick, A Saetta, et al. EMQN best practice guidelines for analysis and reporting of microsatellite instability in solid tumours. Eur J Hum Genet. 2025, 34(1):134–146.

[10] Fu X, Huang J, Fan X, et al. Head-to-head comparative study: evaluating three panels for MSI-PCR testing in patients with colorectal and gastric cancer. J Clin Pathol. 2024, 77(10):683-689.

人微卫星不稳定性（MSI）基因检测试剂盒（多重荧光PCR-毛细管电泳法）（注册证号：国械注准20233400851），是第一个按照《微卫星不稳定性（MSI）检测试剂临床试验注册审查指导原则》指导完成的 MSI 检测试剂盒，试剂盒包含6个单核苷酸位点BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27，MONO-27用于MSI结果判读，2个五核苷酸位点（Penta C、Penta D）和1个性位点（Amel）用于样本质控。试剂盒检测样本类型为FFPE肿瘤组织样本及对照样本（FFPE癌旁样本或外周血），对不同突变类型均能准确检出（无位点不稳定，判定为MSS；1个位点不稳定，判定为MSL-L；≥2个位点不稳定，判定为MSI-H）。在多中心临床试验中，入组的1123例临床样本MSI检测结果与IHC检测结果比较，阳性符合率达到95.60%，阴性符合率达到98.40%，总符合率为97.77%。

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